miR-149-3p在先天性心臟病胎鼠心臟組織中的表達及其對P19細胞分化的影響

胡丹慧，羅慧臣，劉海英

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是常見的新生兒先天性缺陷疾病，每年影響全球約0．9%的嬰兒，而且心臟發育障礙會導致多種缺陷［1-3］。CHD是一個廣泛的概念，主要包括房間隔缺損、室間隔缺損、肺動脈瓣狹窄、主動脈瓣狹窄、主動脈縮窄和動脈導管未閉等類型。據估計，產前死亡的胎兒中超過40% 由CHD 造成［4］。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是長度較小且高度保守的非編碼RNA，在各種病理生理狀態中有復雜的作用［4］。研究表明，miRNA 在心臟胚胎發育、正常心血管功能以及CHD的發病中發揮重要調控作用，成為近年來心臟相關疾病研究的熱點［5］。有研究報道，miR-149可以在體外促進小鼠骨髓間充質干細胞的心肌分化［6］。miR-149 的基因多態性與心腦血管疾病有關［5］。熱休克蛋白家族B 成員6（heat shock protein family B member 6，HSPB6，又稱HSP20）在心肌組織中高表達，參與多種心臟相關生理病理過程的調節，如增強心臟收縮功能、改善心肌缺血/再灌注損傷等［7］。此外，體內外研究顯示HSPB6 可以保護心肌細胞免于凋亡［8］。然而，miR-149-3p 是否靶向HSPB6 參與CHD 調控還有待研究。本研究通過構建CHD室間隔缺損小鼠模型，探討CHD胎鼠心臟組織中HSPB6 和miR-149-3p 的表達情況，并采用體外實驗分析miR-149-3p 是否通過靶向下調HSPB6影響P19細胞向心肌細胞分化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8周齡ICR小鼠60只，雌雄比例3∶1，體質量25～30 g，均購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2019-0035。小鼠飼養于22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h 明暗交替的環境中，自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠畸胎瘤P19 細胞購自美國模式培養物保藏中心；α-MEM 培養基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；丙戊酸（VPA）購自德國Merck 公司；miR-149-3p 過表達慢病毒載體構建、擴增、包裝，慢病毒濃縮、純化及慢病毒滴度測定由漢恒生物科技（上海）有限公司完成；嘌呤霉素購自美國Thermo Fisher公司；二甲基亞砜（DMSO）和DAPI 購自北京Solarbio 公司；Trizol、反轉錄（RT）試劑盒和SYBR Green PCR Kit購自日本TaKaRa公司；Hairpin-itTMmiRNA qPCR Quantitation Kit 購自上海吉瑪制藥技術有限公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；小鼠抗人心肌鈣蛋白I（cTnI）單克隆抗體購自于英國Abcam 公司；小鼠抗人HSPB6 抗體和兔抗人GAPDH 抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗小鼠熒光二抗IgG488購自上海碧云天生物技術有限公司。石蠟包埋機和切片機購自德國徠卡公司；獨立控溫PCR 儀和實時熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國ABI公司；化學發光檢測系統購自上海Tanon公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠CHD 室間隔缺損模型建立［9］將發情期雌鼠和雄鼠按3∶1的比例進行合籠過夜，次日查見陰栓的雌鼠作為妊娠第1天。選取20只妊娠第7天的孕鼠，采用隨機數字表法分為造模組和正常組，每組10只。造模組按700 mg/kg的劑量腹腔注射1次VPA，正常組腹腔注射等量的0．9%NaCl溶液。

1.3.2 胎鼠心臟組織病理學檢測 妊娠第19天取出胎鼠，分離心臟，沿縱切面一分為二，分別用于HE染色和qPCR檢測。用4%多聚甲醛固定胎鼠心臟組織24 h，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后，切片烤片。之后切片經二甲苯脫蠟，乙醇復水，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，伊紅溶液染色。脫水、透明后封片。用光學顯微鏡觀察染色后的組織切片，若在連續切片中觀察到心臟室間隔存在連續性中斷，則確認為胎鼠心臟室間隔缺損即造模成功，并將造模成功的胎鼠納入CHD組。

1.3.3 細胞培養及向心肌細胞誘導分化 用含10%FBS 的α-MEM完全培養基培養P19細胞，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。誘導分化：取處于對數生長期的P19細胞，以1×106個/mL密度接種于培養皿中，用α-MEM培養基（含1%DMSO）重懸，作為誘導培養的第0 天。之后每隔2 d 進行1 次半量換液，在誘導第4天晚上，取30～50個胚胎樣小體接種至6孔板中，用α-MEM培養基（無DMSO）培養，隨后每隔2 d進行1次全量換液，分別于誘導培養的第0、5、10天收集細胞。

1.3.4 慢病毒感染 將對數生長期的P19細胞按照3×105個/孔密度接種至6孔板中。將細胞分為空白對照組（blank組）、空載組（Vector 組）和miR-149-3p 過表達組（miR-149-3p組）。待細胞融合度達到60%時，按照50∶1的病毒感染比例取空載或miR-149-3p過表達慢病毒（病毒滴度1．5×108TU/mL）感染P19 細胞。感染6～8 h 后，換液繼續培養。待感染48 h后，加入終質量濃度為0．5 mg/L的嘌呤霉素繼續培養，用于篩選穩定表達株，qPCR檢測miR-149-3p的表達。

1.3.5 qPCR檢測 取胎鼠心臟組織、DMSO誘導分化的P19細胞或慢病毒感染后的P19 細胞，采用Trizol 法提取組織或細胞總RNA，采用分光光度計對RNA進行定量后，再使用反轉錄試劑盒將總RNA 反轉錄成cDNA，依照Hairpin-itTMmiRNA qPCR Quantitation Kit和SYBR Green PCR Kit說明書，通過qPCR 分別檢測miR-149-3p 和其他基因的表達水平。引物序列見表1。反應條件為：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃45 s，40個循環；72 ℃5 min。miR-149-3p以U6為內參，其他基因mRNA 以GAPDH 為內參，采用2－ΔΔCt法計算各組樣本中miR-149-3p、HSPB6、GATA4、cTnT、ANP mRNA的相對表達量。

Tab.1 The primer sequences of real-time fluorescent quantitative PCR表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3.6 Western blot 檢測 取慢病毒感染后的各組P19 細胞沉淀，采用RIPA 裂解緩沖液裂解各組細胞，在4 ℃條件下離心抽提總蛋白，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。各組取等量的蛋白進行SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜，之后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，在4 ℃下加入一抗HSPB6（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）孵育過夜。次日，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，膜上滴加ECL 進行曝光。以GAPDH 為內參，對各組蛋白進行半定量分析。

1.3.7 免疫熒光染色 取慢病毒感染后的各組P19細胞，以1×106個/mL的密度接種于培養皿中，加入1%DMSO誘導P19細胞分化。在分化的第9 天，按照3×105個/孔接種至6 孔板中（放有蓋玻片），培養至分化第10天。用PBS輕輕洗滌在蓋玻片上生長的細胞，在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min后，將細胞用0．1%NP-40透化5 min，并用5%山羊血清封閉1 h；加入cTnI單克隆抗體（1∶50），室溫孵育1 h，再加入熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育1 h。用DAPI 對細胞核進行復染，在載玻片上滴加防淬滅劑后封片。用熒光顯微鏡進行觀察，每組中隨機讀取5個視野并拍攝照片，統計其中cTnI陽性的細胞數。以cTnI 陽性細胞數與視野內總細胞數的比值計算心肌細胞分化率。

1.3.8 雙熒光素酶報告實驗 采用TargetScan 7．2 軟件預測HSPB6的3′-UTR 上假定的miR-149-3p識別位點，據此構建含HSPB6 3'-UTR 野生型（WT，序列GGGAGGG）和突變型（MUT，序列GAAGAGG）報告質粒。當空載組和miR-149-3p過表達組細胞融合度達到60%左右時，利用Lipofectamine 3000 試劑將HSPB6-WT 和HSPB6-MUT 報告載體轉染至各組細胞。待轉染48 h 后，收集各組細胞，參照雙熒光素酶報告系統說明書檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性為參照來計算各組相對酶活性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22．0 統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胎鼠心臟組織病理學變化 HE染色結果顯示，正常組胎鼠心臟組織室間隔整齊，動脈瓣膜以及房室瓣膜發育較成熟，大血管發育良好，而CHD組胎鼠心臟組織連續切片存在室間隔連續性中斷，室間隔缺損較為明顯，血管發育不完善，見圖1。

Fig．1 Histopathological changes of fetal mouse heart tissue(HE staining,×400)圖1 胎鼠心臟組織病理學變化（HE染色，×400）

2.2 各組胎鼠心臟組織中miR-149-3p 的表達水平 qPCR 結果顯示，與正常組比較，CHD 組胎鼠心臟組織中miR-149-3p 表達水平明顯升高（5．415±0．904vs.1．004±0．072；n=10，t=15．376，P＜0．01）。

2.3 miR-149-3p 在P19 細胞向心肌細胞分化過程中的表達變化 qPCR 結果顯示，DMSO 誘導P19 細胞向心肌細胞分化第0、5 和10 天心肌分化標志物GATA4、cTnT和ANP mRNA表達水平不斷升高（P＜0．01），P19細胞成功向心肌細胞分化。與此同時，在該誘導分化過程中miR-149-3p 表達水平不斷降低（P＜0．05），見表2。

Tab.2 Changes in expression levels of GATA4,cTnT and ANP mRNA and miR-149-3p during the process of inducing differentiation表2 誘導分化過程中GATA4、cTnT、ANP mRNA和miR-149-3p表達變化（n=3，±s）

Tab.2 Changes in expression levels of GATA4,cTnT and ANP mRNA and miR-149-3p during the process of inducing differentiation表2 誘導分化過程中GATA4、cTnT、ANP mRNA和miR-149-3p表達變化（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與第0天比較，b與第5天比較，P＜0．05。

時間第0天第5天第10天F GATA4 0．973±0．023 3．367±0．751a 7．333±0．651b 94．072＊＊cTnT 0．950±0．030 4．600±0．614a 9．167±0．777b 155．374＊＊ANP 0．987±0．086 3．500±0．755a 8．233±0．666b 119．370＊＊miR-149-3p 1．009±0．076 0．449±0．120a 0．216±0．071b 59．349＊＊

2.4 miR-149-3p 過表達抑制P19 細胞向心肌細胞分化 qPCR結果顯示，慢病毒感染后，與blank組或Vector 組比較，miR-149-3p 組細胞中miR-149-3p表達水平明顯升高（P＜0．01），見表3。各組P19 細胞向心肌細胞誘導分化第10 天，免疫熒光結果顯示，blank組和Vector組均有較強的cTnI蛋白綠色熒光，而miR-149-3p 組cTnI 蛋白綠色熒光明顯減弱且含有綠色熒光的細胞數也明顯減少，見圖2。與blank 組或Vector 組比較，miR-149-3p 組心肌細胞分化率明顯降低（P＜0．01），見表3。qPCR 結果顯示，與blank 組或Vector 組比較，miR-149-3p 組細胞內心肌分化標志物GATA4、cTnT和ANP mRNA表達水平顯著降低（P＜0．01），見表4。

Tab.3 Effects of miR-149-3p overexpression on miR-149-3p expression and cardiomyocyte differentiation during P19 cell differentiation into cardiomyocytes表3 miR-149-3p過表達對P19細胞向心肌細胞分化過程中miR-149-3p表達和心肌細胞分化率的影響（n=3，±s）

Tab.3 Effects of miR-149-3p overexpression on miR-149-3p expression and cardiomyocyte differentiation during P19 cell differentiation into cardiomyocytes表3 miR-149-3p過表達對P19細胞向心肌細胞分化過程中miR-149-3p表達和心肌細胞分化率的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與blank組比較，b與Vector組比較，P＜0．05；表4、5同。

組別blank組Vector組miR-149-3p組F miR-149-3p 1．007±0．021 1．033±0．025 5．277±0．677ab 118．404＊＊心肌細胞分化率（%）67．977±5．234 66．403±6．330 21．840±6．719ab 54．832＊＊

Fig．2 The expression of cTnI protein(cellular immunofluorescence,×400)圖2 cTnI蛋白的表達情況（細胞免疫熒光，×400）

Tab.4 Effects of miR-149-3p overexpression on GATA4,cTnT and ANP mRNA expressions during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表4 miR-149-3p過表達對P19細胞向心肌細胞分化過程中GATA4、cTnT和ANP mRNA表達的影響（n=3，±s）

Tab.4 Effects of miR-149-3p overexpression on GATA4,cTnT and ANP mRNA expressions during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表4 miR-149-3p過表達對P19細胞向心肌細胞分化過程中GATA4、cTnT和ANP mRNA表達的影響（n=3，±s）

組別blank組Vector組miR-149-3p組F GATA4 0．993±0．088 1．007±0．089 0．364±0．062ab 62．128＊＊cTnT 1．009±0．087 1．028±0．085 0．290±0．075ab 77．285＊＊ANP 0．969±0．043 1．002±0．099 0．305±0．099ab 65．468＊＊

2.5 miR-149-3p 通過靶向下調HSPB6 影響P19 細胞向心肌細胞分化 與正常組相比，CHD 組胎鼠心臟組織中HSPB6 mRNA 表達水平明顯降低（0．323±0．081 和0．991±0．066；n=10，t=20．252，P＜0．01）。經1%DMSO誘導P19細胞向心肌細胞分化第0、5和10天過程中HSPB6 mRNA 表達水平不斷升高（依次為0．967±0．026、2．189±0．339 和4．113±0．309；n=3，F=107．269，P＜0．01）。

與blank 組或Vector 組比較，miR-149-3p 過表達后P19細胞中HSPB6 mRNA及蛋白表達顯著降低（P＜0．05），見圖3、表5。TargetScan 7．2 軟件預測結果顯示，HSPB6 基因3'-UTR 區域上存在與miR-149-3p 結合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗結果證實，過表達miR-149-3p可使得HSPB6-WT報告基因的相對熒光素酶活性顯著降低（0．532±0．098和1．000±0．045；n=3，t=7．495，P＜0．01）；而過表達miR-149-3p 對HSPB6-MUT 報告基因的相對熒光素酶活性無明顯影響（1．010±0．091 和0．993±0．080；n=3，t=0．232，P＞0．05）。

Fig．3 The expression of HSPB6 protein圖3 HSPB6蛋白的表達情況

Tab.5 Effects of miR-149-3p overexpression on HSPB6 mRNA and protein expression during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表5 miR-149-3p過表達對P19細胞向心肌細胞分化過程中HSPB6 mRNA和蛋白表達的影響（n=3，±s）

Tab.5 Effects of miR-149-3p overexpression on HSPB6 mRNA and protein expression during the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes表5 miR-149-3p過表達對P19細胞向心肌細胞分化過程中HSPB6 mRNA和蛋白表達的影響（n=3，±s）

組別blank組Vector組miR-149-3p組F HSPB6 mRNA 1．010±0．084 1．000±0．116 0．217±0．083ab 67．815＊＊HSPB6蛋白1．098±0．180 1．136±0．059 0．458±0．099ab 28．391＊＊

Fig．4 The targeting site of miR-149-3p and HSPB6圖4 miR-149-3p與HSPB6的靶向結合位點

3 討論

心臟在胚胎發育過程中受到多種因素調控和影響，任何微小差錯都可能導致心房、心室和瓣膜等心臟結構發生病變，從而導致CHD 的發生［10］。研究CHD 的病因和發病機制對于CHD 的預防和治療至關重要。CHD小鼠是理想的CHD動物模型，向孕期小鼠腹腔注射VPA，誘導胚胎心臟畸形的產生，其操作難度低，檢測指標簡單易行［9］。本研究采用孕鼠腹腔注射VPA成功構建了CHD胎鼠模型。

miRNA 在心臟胚胎發育、維持正常心血管功能及CHD發病中發揮重要調控作用［5］。miR-23b可靶向GATA6下調類胰島素生長因子1（IGF-1），從而促進CHD 的發展［11］；miR-219-5p 通過調節心肌細胞凋亡參與紫紺型CHD 進展［12］。有研究報道，miR-149可以促進小鼠骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化［6］，其基因的多態性與心腦血管疾病有關［5］。以上研究表明，miR-149-3p 可能參與CHD 以及其他心臟疾病的進展。本研究發現，CHD 胎鼠心臟組織中miR-149-3p高表達，而在P19細胞誘導分化過程中miR-149-3p 表達水平則不斷下降，提示miR-149-3p高表達可能不利于P19細胞向心肌細胞分化。體外細胞實驗發現，在P19細胞誘導分化過程中，miR-149-3p過表達可以明顯降低P19細胞向心肌細胞分化，同時下調心肌細胞分化標志物GATA4、cTnT 和ANP 的表達。由此說明miR-149-3p 過表達可以抑制P19細胞向心肌細胞分化，提示miR-149-3p高表達可能是參與CHD發病的重要病理因素。

HSP 是一個高度保守的分子伴侶家族，可作為細胞的“防御者”，保護細胞免受內外刺激和損傷。作為HSP家族成員，HSPB6在心肌組織中高表達，具有顯著的心臟保護能力，其過表達可改善藥物性心臟損傷；HSPB6還是一種血管舒張劑，可減少與靜脈移植相關的血管痙攣和血栓形成［7］。HSPB6不但可以降低氧氣/葡萄糖剝奪/再灌注誘導的細胞器損傷和細胞凋亡的水平［13］，還可促進血管內皮生長因子等的分泌，激活血管內皮生長因子受體2，誘導心肌血管生成［14-15］。也有研究報道，miR-23a-5p可通過靶向HSPB6/ASK1參與調節脂多糖誘導的急性肺損傷［16］；miR-34a-5p 可能調控HSPB6 的激活，從而誘導膀胱癌腫瘤細胞的血管生成過程［14］。miR-149-3p能否通過靶向下調HSPB6表達影響P19細胞向心肌細胞分化尚不明確。本研究結果發現，在CHD胎鼠心臟組織中以及在P19細胞向心肌細胞分化過程中，HSPB6 的表達趨勢與miR-149-3p 相反，提示miR-149-3p 與HSPB6 可能存在靶向調控關系。生物信息學軟件預測結果顯示，HSPB6基因3'-UTR區存在與miR-149-3p結合的位點，雙熒光素酶報告基因實驗結果證實miR-149-3p可以靶向調控HSPB6。

綜上所述，miR-149-3p可能通過靶向下調HSPB6影響心肌細胞分化進而參與CHD的病理機制，這可能為CHD的預防和治療提供新的潛在靶點。當然，HSPB6基因過表達是否可逆轉miR-149-3p 對P19細胞向心肌細胞分化的抑制作用還需進一步證實。