基于主要成分分析不同大米肽的品質與綜合評價

胡武瑤，黃晶，黃瑩，趙彤，陳曦，楊曉*

中國健康促進基金會抗衰老營養與健康研發中心（武漢 430000）

大米肽主要含有肽混合物及少量的游離氨基酸、水分、糖分和無機鹽[1]*，具有低敏性[2]*、易消化吸收[3]*以及生物學效應[4]*的特點。大米肽的氨基酸構成模式與人體的需求模式基本一致[5]*，能夠為人體提供所需的各種氨基酸和肽營養。大米肽還具有調節機體生理活動的保健功能，如降血脂[3]*、降膽固醇[4-5]*、降血壓[6]*、抗氧化[7]*、增強肌肉[8]*等作用。大米肽已被國家衛生健康委員會批準為具有免疫功能的食品，且已被作為功能性成分添加到保健食品中。

隨著對大米肽功能的深入研究，大米肽在食品中的應用也逐漸廣泛，它可以改變食品的品質、風味，也能增強食品的功能性[9]*，由于目前缺乏大米肽的國家或者行業標準，導致市面上大米肽的品質參差不齊。大米肽的品質決定其營養特性和功能特性[10]*，因此此次研究采用高效凝膠色譜法和氨基酸分析儀等技術，以大米肽的蛋白質含量、肽含量、分子量分布和氨基酸分析作為品質評價指標，并結合主成分分析對23種不同大米肽進行品質綜合評價，以期為市場上大米肽的品質鑒定提供理論依據，為大米肽生產企業和大米肽產品提供產品標準的理論依據，有利于促進大米肽行業的技術水平和市場的迅速發展。

1 材料與方法

1.1 主要設備與試劑

S-433Dup全自動氨基酸分析儀[賽卡姆（北京）科學儀器有限公司]；MTN-2800D-12氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜（配有GPC數據處理軟件，美國Agilent公司）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；K1100全自動凱式定氮儀（海能未來技術集團股份有限公司）；JRX-10S曲線升溫消化爐（濟南精銳分析儀器有限公司）；202-2AB電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AB204-A分析天平（上海梅特勒-托利多儀器公司）。

鈉緩沖液A-1、鈉緩沖液B-1、鈉樣品稀釋液、17種氨基酸混合標樣、鉀鈉緩沖液、鈉再生液、茚三酮[賽卡姆（北京）科學儀器有限公司]；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、三氯乙酸（色譜純）、胰島素、桿菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（上海安譜科學儀器有限公司）；濃鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；23種大米肽采購自23家不同的生物科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白質含量測定

參考GB 5009.5—2016[11]*中第一法凱氏定氮法測定蛋白質含量。

1.2.2 肽含量測定

準確稱取1.00 g樣品，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容至50 mL，混勻靜置5 min，過濾去除初濾液，濾液作為備用液。然后測定濾液中的蛋白質含量，測得的結果即為酸溶蛋白的含量。

稱取30.00 mg的大米肽粉，用稀釋液定容至10 mL，然后離心取上清液，用0.22 μm濾膜過濾后用氨基酸自動分析儀以外標法測定大米肽樣品中的游離氨基酸，肽含量按式（1）計算。

1.2.3 相對分子量分布測定

本次臨床試驗，共發現不良事件19例，其中試驗組9例（7.63%），對照組10例（8.33%），兩組比較，差異無統計學意義。經研究者判定為不良反應7例，其中試驗組4例（3.39%），對照組3例（2.50%），均表現為皮膚刺激癥狀，兩組比較，差異也無統計學意義。兩組生命體征及實驗室檢查，未發現有臨床意義的異常改變。

采用高效凝膠色譜法（High performance gel chromatography，HPGFC）測定大米肽樣品的分子量分布。

標準曲線制作：用流動相配制質量濃度為1 mg/mL的不同相對分子質量的胰島素、桿菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的肽標準品溶液，按一定比例混勻后，用0.22 μm有機濾膜過濾后進樣，即可得到標準品色譜圖，以相對分子質量的對數對保留時間作線性回歸方程。

樣品處理：準確稱取10.00 mg大米肽樣品于10 mL容量瓶種，用流動相定容，過0.22 μm有機濾膜過濾，濾液即為待測樣品。

色譜條件：色譜柱 TSK-GELG 2000swxL300 mm×7.8 mm；流動相：V乙腈+V水+V三氯乙酸=20+80+0.1；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；檢測時間：30 min；進樣體積：20 μL；柱溫：室溫。

1.2.4 氨基酸組成和含量測定

稱取80.00 mg大米肽樣品于水解管中，加10 mL 6 mol/L的HCl（含0.2%苯酚），吹氮氣3～5 min后擰緊瓶蓋，放入110 ℃烘箱中水解22 h，冷卻至室溫，將水解液轉移至25 mL容量瓶中，用超純水定容并過濾。取0.5 mL濾液至蒸發皿中，在60 ℃烘箱中蒸干，蒸干后加0.5 mL超純水，蒸干，再加0.5 mL超純水，蒸干。加入3 mL樣品稀釋液，待完全溶解后用0.22 μm濾膜過濾，取0.3 mL濾液加0.6 mL樣品稀釋液，用氨基酸自動分析儀以外標法測定大米肽樣品中的氨基酸組成和含量。

1.2.5 綜合評價方法

1.2.6 統計分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行數據處理與主成分分析。

2 結果與討論

2.1 23種大米肽的蛋白質含量分析

23種大米肽的蛋白質含量結果見表1。從表1可以看出：蛋白質含量≥90%的樣品占26.1%；85%≤蛋白含量＜90%的樣品占56.5%；80%≤蛋白含量＜85%的樣品占17.4.0%。這說明大米肽的蛋白含量較高，是很好的蛋白質來源。23種大米肽的蛋白含量各不相同，這可能是因為其原料來源和工藝差異造成的[12]*。

表1 23種大米肽的蛋白質含量測定結果

蛋白質含量的高低是衡量以蛋白為主要成分的產品品質的重要指標之一。由于目前缺乏大米肽的國標，參考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[13]*按蛋白含量進行質量分級，蛋白含量≥90%為一級，85%≤蛋白含量＜90%為二級，80%≤蛋白含量＜85%為三級。23種大米肽中有26.1%可分為一級，有56.5%可分為二級，有17.4%可分為三級，這說明以蛋白質含量作為評價標準之一時，23種大米肽的質量主要集中在二級。

2.2 23種大米肽的肽含量分析

23種大米肽的肽含量結果如表2所示。結合表1和表2的結果可知，酸溶蛋白含量占總蛋白含量的90%以上樣品占比73.9%，這說明大米肽樣品中小分子量的肽是其主要組成部分，是因為高分子量蛋白質在酸性條件下易被沉淀，較低分子量的蛋白質水解物即酸溶蛋白易溶于酸性溶液[14]*。從表2的游離氨基酸結果可以看出，游離氨基酸含量≥5%的樣品占39.1%，游離氨基酸含量＜5%的樣品占60.9%。大米肽提取過程本質是大米蛋白經酶解的過程。當酶解程度不夠時，水解產物的分子量大，產率低；當水解過度時，會產生大量游離氨基酸，難以得到所需分子量范圍的大米肽產品[15]*，但由于無論如何控制酶水解過程，均會產生一定量的游離氨基酸，所以游離氨基酸含量的指標也可作為衡量大米肽品質的重要參數。

肽含量是評價大米肽品質的關鍵指標之一，因為大米肽的生物活性主要由肽體現，肽含量越高，大米肽純度越高。從表2的肽含量結果可以看出，23種大米肽樣品的肽含量≥80%和肽含量≤70%均僅占17.4%，而70%＜肽含量＜80%的樣品占82.6%，這說明23種大米肽的肽含量主要集中在70%～80%范圍內，且23種大米肽的肽含量均不相同，這可能是因為其水解時所選擇的酶和酶解條件不同所致，酶作為一種具有專一性的特殊蛋白質，其活化中心不同，水解得到的肽片段也將不同，所以水解得到的肽含量也會存在一定的差異[16]*。

表2 23種大米肽的肽含量測定結果

2.3 23種大米肽的分子量分布分析

分子量的大小直接決定了大米肽可被人體吸收利用的效率[17]*，決定著大米肽的營養價值。研究表明，肽段的分子量越小越容易被人體吸收，其生物活性可能越高[18]*，所以分子量分布也是評估大米肽產品品質的關鍵指標之一。23種大米肽的分子量分布的結果如表3所示。23種大米肽的分子量主要集中在2 700 Da以下，且分子量分布主要集中在630～189 Da和1 200～630 Da這兩個區間范圍內，占比分別為33.48%～66.73%和14.29%～26.97%，這說明23種大米肽中小分子肽是其主要組成部分，這與2.2小節中酸溶蛋白結果一致，與王申等[19]*的研究結果相似。23種大米肽的分子量分布均不同，這可能是因為大米肽提取時所用酶不同，而不同酶的酶解位點不同，即使同一大米蛋白在不同蛋白酶的作用下，也會產生不同分子量大小的肽片段。

表3 23種大米肽的分子量分布測定結果 單位：%

接表3

2.4 23種大米肽的氨基酸分析

氨基酸成分分析是研究各種肽類物質構造、特性和營養價值的重要手段[20]*。大米肽的生物活性與其氨基酸組成和含量緊密相關，對23種大米肽進行氨基酸分析，氨基酸組成和含量測定結果見表4，由于采用酸水解法，色氨酸被破壞，故表4中無色氨酸。

從表4可以看出，23種大米肽的氨基酸含量豐富，富含人體所必需氨基酸，且氨基酸組成和含量均不相同。23種大米肽的總氨基酸（TAA）含量在78.31%～100.40%范圍內，必需氨基酸（EAA）的含量在16.31%～32.16%范圍內，EAA占TAA的18.15%～34.46%；疏水氨基酸（HAA）含量在27.34%～59.57%范圍內，HAA占TAA的33.22%～59.33%；支鏈氨基酸（BCAA）的含量在6.96%～17.54%。有研究表明疏水氨基酸與肽的抗氧化活性存在一定的相關性[21]*，疏水性氨基酸含量越高，抗氧化能力越強[22]*。BCAA可通過雷帕霉素機械靶蛋白（mTOR）途徑刺激肌肉合成代謝、抑制運動誘導的肌肉蛋白分解，并在組織生長和修復中其重要作用[23]*。

表4 23種大米肽的水解氨基酸分析 單位：%

23種大米肽均含有較高的谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），其次是精氨酸（Arg）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala），這與周侃等[24]*的研究結果相似。Glu在生物體內的蛋白質代謝過程種占據重要地位，是生物機體內氮代謝的基本氨基酸之一[25]*。Asp是一種良好的營養補充劑，可以用于治療心臟病、肝臟病和高血壓癥，具有防止和恢復疲勞的作用[26]*。Leu具有螯合金屬離子的作用，可通過降低金屬離子的氧化還原電勢來穩定金屬離子的氧化態，從而減少金屬離子的催化氧化，達到抗氧化的作用[27]*。研究報道，Arg、Leu、Ala、纈氨酸（Vla）、酪氨酸（Tyr）等與肽的抗氧化活性有關[28]*。

接表4

2.5 23種大米肽的品質綜合評價

表5中顯示了主成分方差貢獻率，表6顯示了主成分載荷矩陣。從表5可以看出，主成分1和主成分2的累計貢獻率為82.631%，說明兩個主成分可基本代表最初變量的所有信息。從表6可以看出，對第1主成分正向影響較大的為肽含量、酸溶蛋白含量和HAA/TAA含量，載荷數分別為0.971，0.942和0.914。以各個指標的載荷權數和主成分特征值，計算各指標的特征向量。用特征向量為權重，得出主成分得分Z的計算公式：

表5 主成分方差貢獻率

表6 品質指標的主成分載荷矩陣

式中：Z1、Z2分別是第1和第2主成分得分；X1～X7分別為大米肽的蛋白、酸溶蛋白量、游離氨基酸、肽、分子量分布在1 200～189肽段、EAA/TAA和HAA/TAA含量。以各主成分對應的方差貢獻率作為權重，由主成分得分和對應的權重線性加權求和，得到品質綜合評價模型F，如式（4）所示。

根據模型計算出23種大米肽品質的綜合評價值并進行排序，結果見表7。從表7可以看出，樣16、樣18和樣4是綜合評價排名前3的大米肽樣品。

表7 23種大米肽的主成分得分與排序

3 結論

隨著大米肽的功能性被逐漸發掘，市面上也出現了越來越多的大米肽產品，但是大米肽的品質參次不齊，難以判別其品質優劣。此次研究以23種大米肽的蛋白質含量、肽含量、分子量分布、氨基酸分析作為品質評價指標，采用主成分分析法建立了不同大米肽品質綜合評價模型。結果顯示：23種大米肽的蛋白含量均大于80%，且56.5%的大米肽的蛋白含量在85%～90%的范圍內；有86.2%大米肽的肽含量在70%～80%范圍內，其分子量均主要集中在2 700 Da以下，且分子量在630～189 Da為其主要組成部分占大米肽的33.48%～66.73%；均含有人體必需氨基酸，Glu和Asp是大米肽中含量較高的氨基酸；采用主成分分析對23種大米肽樣品進行品質綜合評價，結果顯示樣16、樣18和樣4是綜合評價靠前的大米肽樣品。目前由于缺乏對大米肽提取原料的分析對比研究，酶解技術尚不成熟以及缺乏生產標準體系的參考，導致各企業所生產的大米肽品質良莠不齊，從而限制了大米肽進一步市場化，影響了大米肽在普通食品、保健食品、烘焙食品以及嬰幼兒食品等中的應用。此次研究通過對23種大米肽的品質分析與綜合評價，對大米肽工業化生產過程中的品質控制具有一定的參考價值，從而促進大米肽行業技術水平的提升，有利于大米肽產業的發展。