特醫食品中VC檢測關鍵控制點及穩定性研究

范春婷，殷耀，張萍，陸慧媛*，張曉燕，沈偉健

南京海關動植物與食品檢測中心（南京 210019）

維生素C（Vitamin C，VC）作為特殊醫學用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，FSMP）（以下簡稱特醫食品）中重要的營養元素，具有促進抗體形成、促進鐵吸收、清除自由基等功能[1]*。但因其對光、熱、氧等極不穩定的特性[2]*，使得快速、準確測定特醫產品中VC的含量成為行業難點。根據現行國家標準[3]*，特醫食品中VC的檢測方法GB 5413.18—2010[4]*存在前處理過程過濾困難、濾液不澄清等缺點[5]*。目前，VC檢測方法還有二氯靛酚滴定法[6-7]*、紫外分光光度法[8-10]*和高效液相色譜法[11-12]*。GB 5009.86—2016[13]*包含了除熒光法之外的3種方法，但此標準適用范圍也不包含特醫食品，且前處理過程因特醫食品富含蛋白質的特性，影響定量。食品及藥品中VC的穩定性一直備受關注[14-17]*，但目前未見關于特醫食品尤其是特醫食品液態產品中VC穩定性的研究。因此，研究并掌握特醫食品中VC的降解規律，找到可有效保持其穩定的方法成為特醫食品研發、生產過程中的一個重要環節。

此次研究對GB 5009.86—2016[13]*的液相色譜法進行優化，將蛋白沉淀作為前處理的關鍵控制點，建立回收率穩定且更適于特醫食品VC的測定方法；并對特醫食品液態產品中的VC進行穩定性考察，為特醫食品中VC的檢測和研發提供技術保障及參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SQP Quintix224-1 cn電子天平（德國賽多利斯公司）；Sigma2-16K臺式冷凍離心機（德國Sigma公司）。

維生素C標準品（純度99.98%，Sigma Aldrich）；磷酸、偏磷酸、乙酸鋅、磷酸二氫鉀，均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇，色譜純（美國 默克公司）。

所有特醫食品樣品均來源于南京海關動植物與食品檢測中心送檢的委托樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

維生素C標準溶液配制（現配現用）：稱取0.01 g（精確至0.000 1 g）維生素C標準品于10 mL棕色容量瓶中，用偏磷酸溶液（20 g/L）溶解并定容。

偏磷酸溶液：稱取20 g（精確至0.1 g）偏磷酸，溶于水并稀釋至1 L。

200 g/L乙酸鋅溶液：稱取200 g（精確至0.1 g）乙酸鋅，加入水溶解至1 L。

1.2.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 200 g/L乙酸鋅溶液，加入20 g/L偏磷酸溶液震搖溶解并定容。搖勻，全部轉移至50 mL離心管中，超聲提取5 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm水相膜，待分析。

1.2.3 色譜條件

儀器及色譜條件參考GB 5009.86—2016[13]*第一法高效液相色譜法6.4儀器參考條件。

1.3 特醫食品中VC穩定性研究

依據《特殊醫學用途配方食品穩定性研究要求（試行）》（2017版）的相關規定，選取不同特醫食品液態樣品，對其貯藏過程中VC含量的穩定性進行跟蹤試驗。

1.3.1 加速、長期和影響因素試驗

將樣品分別存放于不同藥品穩定性試驗箱中（已通過相應溫濕度檢定），進行加速試驗和長期試驗，溫、濕度分別為30±2 ℃，Hr60%±5%和25±2 ℃，Hr60%±10%。影響因素考察高溫和高濕條件，條件分別為40 ℃，60 ℃和光照4 500 Lx±500 Lx。加速試驗于第0，第1，第2，第3，第4和第5個月取出檢測，長期試驗于第0，第3，第6，第9，第12和第15個月取出檢測，影響因素于第5天和第10天取出檢測。

1.3.2 使用中穩定性試驗

將樣品開封后，放置1 min，蓋上蓋子分別置于4～8 ℃或25±2 ℃條件下存放24 h，然后檢測。

1.4 數據處理

檢測數據、色譜圖、標準曲線圖采用液相色譜儀自帶工作站的數據分析軟件處理，表格及圖像數據統計分析用Excel 2019及Origin 8.5處理。

2 結果與討論

2.1 維生素C標準物質分析

參照GB 5009.86—2016[13]*第一法，采用液相色譜儀對維生素C標準溶液進行分析，結果顯示，目標物在8.4 min出峰，峰形尖銳，總分析時長13 min，在0.5～50 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=88.704 98X，相關系數0.999 96（詳見圖1）。按3倍信噪比確定此方法檢出限為0.5 mg/100 g，10倍信噪比確定定量限為2 mg/100 g。

圖1 維生素C液相色譜圖及標準曲線

2.2 蛋白沉淀劑的選擇

擬在GB 5009.86—2016[13]*第一法的基礎上，增加蛋白沉淀步驟。常用的蛋白沉淀劑包括金屬鹽、有機溶劑等[18]*。其中，乙醇可以使蛋白質和溶劑分子之間的相互作用減弱，使蛋白質發生聚集而沉淀[19]*；乙酸鋅可以通過降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出[20]*。研究比較無水乙醇和乙酸鋅對樣品中蛋白質的沉淀效果。結果顯示，無水乙醇含量達50%時沉淀效果較好，但此時色譜峰變寬，峰形差（詳見圖2a），且回收率僅70%左右，經分析可能是提取液中較高含量的乙醇使VC在色譜柱上的保留性變差導致的；而乙酸鋅既可以很好地沉淀蛋白，又不會影響VC在色譜柱上的保留性，色譜峰對稱且尖銳（圖2b）。

圖2 樣品及維生素C標準溶液色譜圖

基于上述結果，對乙酸鋅的最佳使用量進行摸索。固態基質樣品分別加入0.2，0.4和0.8 g乙酸鋅，液態基質樣品分別加入0.1，0.2和0.3 g乙酸鋅。結果表明，固態基質樣品中，0.2 g乙酸鋅蛋白沉淀效果較差，提取離心后樣品溶液仍渾濁（圖3a），0.4 g和0.8 g乙酸鋅可以獲得較清澈的樣品溶液（圖3b，圖3c），本著節約試劑的原則，選擇0.4 g乙酸鋅作為特醫食品固態基質樣品蛋白沉淀劑；而0.1 g乙酸鋅固體即可在液態基質樣品中達到較好沉淀效果（圖4a），故選擇0.1 g乙酸鋅作為液態基質樣品蛋白沉淀劑。

圖3 固態基質特醫食品乙酸鋅蛋白沉淀效果

圖4 液態基質特醫食品乙酸鋅蛋白沉淀效果

為進一步提升可操作性，研究將乙酸鋅固體配制成200 g/L乙酸鋅溶液。將樣品用偏磷酸溶液溶解后，分別加入2 mL（固態樣品）、0.5 mL（液態樣品），處理后的樣品詳見圖5。試驗發現可以較好地完成過濾和后續檢測。

圖5 乙酸鋅溶液蛋白沉淀效果

2.3 不同特醫食品樣品加標回收試驗

為驗證優化后方法的準確性，選取特醫食品液態及固態基質樣品共24個，進行加標回收試驗。結果顯示，液態基質特醫食品加標回收率范圍95.6%～104.2%，固態基質特醫食品加標回收率范圍95.9%～102.2%（詳見表1），均符合GB/T 27417[21]*的要求，表明此方法重復性較好，可用于液態和固態特醫食品的檢測。

表1 不同基質特醫食品維生素C加標回收試驗結果

2.4 維生素C穩定性試驗

2.4.1 加速和長期試驗中維生素C穩定性

隨機選取3個特殊醫學用途全營養配方食品液態基質產品進行加速和長期穩定性試驗，對VC的穩定性進行跟蹤檢測。每瓶樣品在檢測前均處于密封狀態，一旦開瓶，立即進行檢測。結果顯示，經5個月加速試驗和15個月長期試驗后，VC含量均明顯降低（圖6，圖7），衰減率分別為30.6%～80.3%和30.0%～78.4%；長期試驗中，VC含量的降低在前3個月最為明顯，衰減率為18.3%～31.0%；第9～第15個月下降趨勢逐漸趨于平緩，衰減率僅為3.4%～4.3%。經分析，可能與樣品中存在殘氧量有關，初期VC氧化較快，隨時間延長殘氧剩余量減少，VC相對穩定。

圖6 加速試驗維生素C含量變化

圖7 長期試驗維生素C含量變化

2.4.2 高溫試驗中維生素C的穩定性

高溫試驗結果表明，溫度對特醫食品貯藏過程中VC的穩定性影響較大，在40 ℃或60 ℃保存10 d，VC的衰減率分別為12.1%～18.2%和36.4%～43.6%（圖8和圖9），且溫度越高，衰減越快，如60 ℃保存5 d，VC衰減率高達22.5%。這個結果與Guerra-Hernandez等[22]*的發現一致，即嬰幼兒液態奶在55 ℃儲藏90 d VC的含量遠低于在20 ℃下儲存的產品。

圖8 高溫試驗40 ℃維生素C含量變化

圖9 高溫試驗60 ℃維生素C含量變化

2.4.3 光照試驗中維生素C的穩定性

選擇實驗室現有的兩種包裝材質，分析不同透光率的包材在特醫食品中VC受光照影響中的作用，包裝材質如圖10所示，特醫食品D使用不透光材質進行包裝，特醫食品E、F使用透光材質進行包裝。結果顯示，在4 500 Lx±500 Lx照度下的第5天和第10天（圖11），不透光材質瓶裝的特醫食品D衰減率分別為0.96%和7.00%，而透光瓶裝特醫食品E、F中VC的衰減率分別為7.95%，12.55%和15.89%，14.67%，由此可見光照對產品中VC的穩定性與包材的透光性有很大關系。這一結果與閻然等[23]*的結果一致，即光照會降低NFC鮮榨橙汁中VC濃度，避光則顯著減少VC的損失。另有研究表明光線會加速VC的降解，其降解反應速率符合一級反應模型[24]*，且自然日光的照射比日光燈的照射損失更快[2]*。

圖10 不透光和透光包裝材質示例

圖11 光照試驗維生素C含量變化

2.4.4 使用中穩定性試驗維生素C的含量變化及保持其穩定性方式確認

結果顯示，樣品開封后，無論常溫或冷藏條件下特醫食品F中VC含量下降均很快，衰減率分別為18.1%和19.0%，經分析，可能與樣品開封后空氣進入瓶中，導致VC發生氧化和降解有關，而與空氣的影響比較，不同貯藏的溫度條件對VC含量的影響不明顯。王亞楠等[25]*也發現菠菜汁中VC保存率與空氣暴露時間的長短有很大關系，暴露時間越長，VC保存率越低。在氧氣作用下，L-抗壞血酸極易被氧化為L-脫氫抗壞血酸，從而導致VC含量的衰減，這與Renner[26]*的研究結果一致，當UHT乳中氧含量達到8～9 mg/L，28 d后UHT乳中VC的損失率達100%。

圖12 使用中穩定性試驗維生素C含量變化

為確認樣品中殘氧及開瓶后產品中空氣進入對樣品中VC穩定性的影響，隨機取一瓶特醫食品液態樣品，首次開瓶進行檢測后立即充入高純氮氣（純度＞99.999%），密封后冷藏保存，分別于不同時間進行檢測，且在每次檢測后都充入氮氣保存，結果發現，樣品中VC含量在3個月內僅下降2.79%，具體數據詳表2。此結果進一步證實樣品中VC的衰減與樣品中殘留空氣有關。

表2 充入氮氣保存特醫食品樣品后維生素C含量的變化結果

3 結論

研究根據特殊醫學用途配方食品的基質特性，確定了特殊醫學用途配方食品中VC檢測的關鍵控制點，利用蛋白沉淀劑凈化樣品，C18色譜柱分離，紫外檢測器定量，建立了一種可準確檢測特殊醫學用途配方食品中VC含量的高效液相色譜檢測法。經實際樣品檢測，該方法穩定、準確、高效。同時，對特殊醫學用途配方食品貯藏過程中VC的穩定性考察結果表明，儲存溫度、光照、包材避光性及樣品瓶中殘留的空氣均可對樣品中的VC造成影響，因此在特醫食品的研發、生產以及儲存過程中均應選擇低溫、避光場所，并采用隔氧、避光的包裝材料，以保證產品中VC的穩定。