基于常規實驗室檢驗結果的布魯菌病預測模型的建立

楊芳，王亞輝，程林，岳奇，楊萍，何玲玲

新疆生產建設兵團第三師總醫院檢驗科 （新疆圖木舒克市 843901）

布魯菌病不僅為社會造成巨大經濟損失，而且嚴重威脅人類身心健康，其主要臨床表現為發熱（波狀熱）、疲勞感、出汗和不適等非特異性流感樣癥狀。由于缺乏典型癥狀與體征，布魯菌病容易與其他疾病混淆。布魯菌病診斷主要依賴實驗室檢查，方法包括細菌培養、血清學檢測或核酸擴增試驗，檢測結果的準確性對布魯菌病的確診和正確治療至關重要[1]。布魯菌的分離培養一直是布魯菌病實驗室診斷的金標準，但由于試驗時間長、生物安全風險高，不適合普遍使用，且在慢性病例與局部感染病例中敏感性較低[2]。血清學檢查依靠布魯菌相關抗體作為間接證據，特異性不高，如抗體未產生或滴度未達到診斷標準，只用血清學檢測可能會導致漏診。核酸擴增法具有靈敏度高、技術簡單、安全快速等特點，但價格昂貴，需要特定的儀器設備，且已康復患者檢查結果可長時間保持陽性，因此其臨床診斷與治療意義不明確。上述3種診斷方法均對實驗室硬件和環境要求較高且費時，不利于臨床醫師的早期臨床決策。多變量預測模型可綜合除實驗室檢查外的多種獨立變量，對個體某種疾病患病風險概率進行預測[3]。目前利用人口學特征與常規生化檢測結果對布魯菌病進行預測診斷的研究較少。本研究通過人口學特征、血常規和肝腎功檢查結果建立布魯菌病診斷模型，以期進行風險評估和疾病早期預警，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為單中心回顧性隊列研究，收集2019年4月至2022年2月我院收治的321例布魯菌病患者為布魯菌病組，選取同期261名健康人群為對照組。其中布魯菌病組男190例，女131例；年齡42～62歲，中位年齡51歲；對照組男132例，女129例，年齡35～56歲，中位年齡49歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究遵守《赫爾辛基宣言》，并經醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批文號202201）。

納入標準：年齡≥18歲；確診布魯菌病，符合《中國布魯菌病診治專家共識》[4]診斷標準。排除標準：合并嚴重心肝腎疾病或全身性疾病；重要實驗室檢查數據缺失。

1.2 方法

1.2.1 平板凝集試驗

試驗步驟參考《布魯氏菌病診斷》[5]（WS/T 269-2019）操作規范，在玻片上加30 ul 待檢血清，然后加30 ul 虎紅平板凝集抗原（遼寧迪浩生物公司，批號：20220302）并用木簽混勻，在5 min 內觀察結果，同時用陰性、陽性血清按照上述步驟進行對照試驗。結果判定標準：出現肉眼可見的凝集反應判定為陽性；液體均勻渾濁、未見凝集反應判定為陰性。

1.2.2 細菌培養

取患者血液樣本置于哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司，批號：20220421B），35℃環境下培養18～24 h，培養后平板出現較濕潤、灰色針尖大小菌落，48 h 后形成圓形、凸起、光滑、較小的灰色菌落，72 h 后逐漸增大，若鏡下見紫色球桿狀、形似血小板樣、多位于破壞細胞內的細菌，則可初步診斷。

1.2.3 數據采集和研究終點

布魯菌病臨床預測模型根據《個體預后或診斷的多變量預測模型透明報告》（Transparent reporting of a multivariable prediction model for individual prognosis or diagnosis，TRIPOD）闡述的方法進行設計與建立[6]。布魯菌病組從電子病歷系統采集患者人口學特征和臨床數據，并根據既往報道[7]及臨床相關性，選擇12 個預測因子，其中包括年齡、性別、白細胞（white blood cell，WBC）計數、中性粒細胞（neutrophil，NEU）計數、血小板（platelet，PLT）水平、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）水平、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）水平、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平、總蛋白（total protein，TP）水平及血清白蛋白（albumin，ALB）水平；同時選取同時期健康人群作為對照組。研究終點為分析布魯菌病的獨立預測因素。

1.3 統計學處理

采用R software（version 4.1.1）軟件進行統計分析。符合正態分布連續變量以±s表示，采用t檢驗；非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，比較采用非參數Mann-Whitney U 秩和檢驗。分類變量以率表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。多因素分析采用二分類Logistics回歸，模型系數檢驗采用Wald檢驗，檢驗值α=0.05。建立模型前，將擬納入變量進行多重共線性檢驗，排除方差膨脹因子＞10的變量，然后將剩余變量納入Logistic回歸模型，在赤池信息量準則下采用逐步回歸法進行變量篩選并建立最終模型。利用模型納入指標建立列線圖進行風險預測，并評價各指標的相對重要性。模型的預測診斷能力和校準度分別采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）的曲線下面積（area under the cure，AUC）和校準曲線進行評價。利用最大約登指數（Youden's index）確定模型和單個指標診斷布魯菌病的敏感性、特異性、陽性預測值（positive predictive value，PPV）和陰性預測值（negative predictive value，NPV）。采用Delong檢驗將最終模型AUC與單個指標進行比較，并采用臨床決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評價模型的臨床實用性。采用Bootstrap法（500次）對模型進行內部驗證。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入研究對象的基線特征

布魯菌病組在年齡、男性患者比例和CRP水平均顯著高于健康組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 納入研究對象基線特征

2.2 布魯菌病相關因素分析

對相關因素進行Logistic回歸分析結果表明，性別、CRP 水平、PLT 水平、Hb 水平、ALB水平和ALT 水平為布魯菌病的獨立預測因素，見表2。

表2 布魯菌病相關因素分析

2.3 預測模型建立

將備選變量納入模型后WBC 和TP 因共線性被剔除，經進一步篩選，逐步回歸模型最終納入6 個變量，其中包括性別、CRP 水平、PLT 水平、Hb 水平、ALB 水平及ALT 水平。模型的敏感性和特異性分別為0.88 和0.82，AUC（95%CI）為0.93（0.92～0.95） （圖1A），校準曲線提示預測概率和實際概率具有較好的一致性（圖1 B）。預測效能最高的單變量為CRP，但其AUC（95%CI）顯著低于模型[0.83（0.80～0.87）vs. 0.93（0.92～0.95），P＜0.01]，見圖2。依據模型結果產生的列線圖和各變量相對重要性見圖3。DCA 曲線提示模型的凈獲利顯著高于單變量CRP（圖4）。內部驗證模型的AUC（95%CI） 為0.93（0.91～0.95），ROC 曲線和校準曲線見圖5。

圖1 逐步回歸模型的ROC 曲線和校準曲線

圖2 模型與CRP 的AUC 面積對比圖

圖3 逐步回歸模型的列線圖和納入因素的相對重要性圖

圖4 預測模型與CRP 的DCA 曲線

圖5 內部驗證模型的ROC 曲線和校準曲線

2.4 預測模型的診斷效能分析

模型對疾病的的預測診斷效能優于單個指標變量，見表3。

表3 模型和單個變量的預測效能

3 討論

近年來，預測模型主要用于布魯菌病流行病學研究[8]。利用人口學特征和常規實驗室檢查數據建立預測模型對布魯菌病進行風險評估和診斷的研究報道較少。本研究所建預測模型中納入的6個預測變量在既往研究中均有報道，但既往研究均為評價單個指標和布魯菌病的相關性。Shi 等[9]在研究中回顧性分析了2 041例布魯菌病患者的臨床特征，其中男性患者占比為77%；施玉靜等[10]分析了我國南北方2015—2016年布魯菌病流行特征，發現病例以青壯年男性（72.9%）為主，本研究中病例組男性比例為59%，男性患布魯菌病的風險為女性的2.84倍，與既往研究結果相似。布魯菌病在男性群體中高發的原因可能為從事牲畜養殖、屠宰、運輸或銷售的人群中男性占比較高，暴露于傳染源的機會較多[11]。CRP 是在機體受到感染或組織損傷時出現的一種急性期反應血漿蛋白。本研究結果中布魯菌病組的CRP 水平較健康組顯著升高，與Hashemi 等[12]的研究結果相似。布魯菌病患者血液中CRP 水平顯著升高的原因可能為布魯菌感染導致機體發生出血急性炎癥反應，且疾病處于活動期，促進CRP 大量合成[13]。Trotta 等[14]近期的一項研究表明，在布魯菌病患者體內血小板可直接與單核細胞和嗜中性粒細胞相互作用，形成復合物，且該交互作用可調節單核細胞和嗜中性粒細胞功能從而增強人體抗感染能力。因此，當發生布魯菌感染時，PLT、單核細胞和NEU 計數可出現升高。本研究中布魯菌病組PLT 計數和NEU 計數均較健康組顯著升高，說明感染導致的免疫細胞計數升高很可能會間接引起PLT 計數增加。早期一項研究[13]分析了212名布魯菌病患者的血液學指標，結果表明71%的患者合并不同程度的貧血，同時53%的患者出現了脾腫大；此外，Olt 等[15]的研究表明布魯菌病與基線血紅蛋白值密切相關。本研究中布魯菌病組血紅蛋白值顯著低于健康組，與既往研究結果相似，分析原因可能與布魯菌感染引發的炎癥有關[16]。急性和慢性布魯菌病常累及肝臟，布魯菌病患者的肝損傷主要表現為轉氨酶及血清白蛋白水平異常，有時會發展為急性肝炎。本研究中布魯菌病組的血清白蛋白和ALT 較健康組差異均有統計學意義，可能原因為布魯桿菌感染引發了肝損害。

以上證據表明本預測模型納入的變量不僅差異有統計學意義，且都具有實際臨床意義，由這些預測因素構成的模型對布魯菌病的預測診斷效能是穩定可靠的。本研究回顧性分析了321例布魯菌病患者及同期261名健康人群的臨床特征和實驗室檢查數據并建立了布魯菌病的預測診斷模型。多因素Logistic回歸結果表明性別、CRP 水平、PLT 水平、Hb 水平、ALB 水平和ALT 水平是布魯菌病的獨立預測因素。根據多因素分析結果建立的預測診斷模型診斷效能較好且預測概率和實際概率具有較好的一致性，內部模型驗證表明模型具有良好的穩定性和可靠性。本研究中預測效能最高的單個指標CRP的AUC（95%CI）達到了0.84（0.81～0.87），但仍顯著低于模型的AUC值。此外，DCA 分析表明模型的凈獲利顯著高于CRP。模型相對于單個變量具有多變量綜合分析的優勢，因此模型對疾病的預測診斷效果優于單個指標。

布魯菌病的診斷金標準是血液培養，并不能直接利用預測模型確診，本研究的意義在于在特異性檢查結果出來前對布魯菌病進行風險評估和早期預警。此外，在不具備血清學檢查、血培養和核酸擴增等檢查條件時，對具有明確的動物制品接觸史且出現類似癥狀的患者，尤其是上述幾項實驗室檢查出現異常者，可利用模型的諾模圖對其進行初步評估，對于診斷概率大的人群需及早進行隔離干預，并進一步行針對性檢查和治療，對布魯菌病的防控、治療及預后具有較強的臨床指導意義。

本研究也存在一定的局限性：研究為回顧性研究，可能會存在混雜因素和選擇性偏倚，但本研究制定了嚴格的納入排除標準，且樣本量較大，一定程度上減少了上述偏倚的風險；模型納入的備選指標數量較少，有可能漏掉一些特異性、敏感性較強的預測因素，未來研究需擴展實驗室檢驗指標；本預測模型只進行了內部驗證，未來可進行前瞻性多中心外部驗證來評價模型的適用性和普遍性。

綜上所述，本研究利用布魯菌病患者的臨床特征和常規實驗室檢查數據建立了布魯菌病的預測診斷模型。性別、CRP、PLT、Hb、ALB 和ALT 是布魯菌病的獨立預測因素。模型的預測效能優于單個指標，本模型為臨床醫師評估布魯菌病風險和預測診斷提供了重要參考依據。