玉米籽粒次生代謝物質(zhì)分布及其抗氧化活性

翟小童，韓 林，喬聰聰，何財(cái)安，劉 芳，楊小霽，李 珊，譚 斌，王 敏,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037；3.西安愛(ài)菊糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司，陜西 西安 710026）

玉米（Zea maysL.）為禾本科玉蜀黍?qū)僖荒晟荼局参铮錉I(yíng)養(yǎng)豐富，是一種較為流行、可被大量使用的全谷物原料[1]。玉米等全谷物原料中除基本營(yíng)養(yǎng)素及膳食纖維外，還富含酚類(lèi)物質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素等具有抗氧化活性的生物活性物質(zhì)。玉米中大多數(shù)的生物活性物質(zhì)存在于玉米皮和胚芽中，這兩個(gè)部位貢獻(xiàn)了玉米總酚含量的87%左右，這些生物活性物質(zhì)可能通過(guò)單個(gè)組分或相互結(jié)合或協(xié)同增效的作用起到各種營(yíng)養(yǎng)健康作用[2-4]。

類(lèi)胡蘿卜素和酚類(lèi)物質(zhì)是玉米籽粒中的重要次生代謝物質(zhì)，其參與玉米生長(zhǎng)代謝過(guò)程，協(xié)助抵抗來(lái)自外部環(huán)境的侵害，同時(shí)賦予玉米籽粒顏色以及不同的風(fēng)味[5]。這些物質(zhì)被人體攝入吸收后依然具有營(yíng)養(yǎng)健康作用，已有研究表明，植物次生代謝物質(zhì)有益于人類(lèi)正常代謝的維護(hù)以及營(yíng)養(yǎng)健康[6]。類(lèi)胡蘿卜素是黃玉米籽粒中十分重要的營(yíng)養(yǎng)素和呈色物質(zhì)，以異戊烯焦磷酸為前體，經(jīng)異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶等的催化，經(jīng)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑產(chǎn)生[7]，被人體吸收后能轉(zhuǎn)化為VA，主要包括葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素。大量研究證明，不能由人體自身合成、只能通過(guò)食物或膳食補(bǔ)充劑獲得的葉黃素和玉米黃質(zhì)在保護(hù)視力、免疫力調(diào)節(jié)以及預(yù)防心血管疾病等方面起著重要作用[8-9]。黃酮類(lèi)化合物和阿魏酸是玉米酚類(lèi)物質(zhì)的重要組成部分，黃玉米粒中的黃酮類(lèi)化合物和阿魏酸多以結(jié)合態(tài)形式（可達(dá)90%以上）存在，它們與總抗氧化活性直接相關(guān)[3]。

此前的研究多集中于玉米基本營(yíng)養(yǎng)組分、常見(jiàn)生物活性成分的組成以及不同加工方式對(duì)其含量及性質(zhì)的影響[10-12]，基于玉米分層剝皮、脫胚工藝及配套裝備的研發(fā)，采用半濕法分層破胚剝皮加工工藝，可實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米籽粒皮層、胚芽、胚乳等不同部位分離提純、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)初步富集的目的，靶向代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用可為進(jìn)一步完善玉米營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成、構(gòu)建其代謝輪廓提供支撐[13]。本研究選用鄭單958為研究對(duì)象，利用分層剝皮碾磨技術(shù)，由外到內(nèi)收集4 個(gè)組分，以玉米類(lèi)胡蘿卜素等特征成分及酚酸等次生代謝物質(zhì)為指標(biāo)，完善玉米活性成分的分布輪廓，明確其與玉米籽粒不同部位抗氧化活性的關(guān)系與貢獻(xiàn)，為營(yíng)養(yǎng)健康玉米食品的創(chuàng)制以及玉米精深加工提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粒（鄭單958） 北京斯恩賽爾生物科技有限公司；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)ChromaDex公司；甲醇、甲基叔丁基醚（methyltert-butylether，MTBE）、N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，MTBSTFA）（均為色譜級(jí)） 美國(guó)TEDIA公司；總抗氧化能力試劑盒 江蘇省南京建成生物工程研究所；乙醇、碳酸氫鈉等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PYG40玉米剝皮機(jī) 陜西漢中三益科技有限責(zé)任公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SB-1200DT超聲波清洗機(jī) 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MD200-2氮吹儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Alliance E2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；1290超高效液相色譜儀、Q TOF 6545質(zhì)譜系統(tǒng) 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將實(shí)驗(yàn)用玉米全籽粒于室溫條件下加水預(yù)潤(rùn)15 min（著水率0.035%），入剝皮機(jī)采用循環(huán)往復(fù)的進(jìn)料方式逐層破胚剝皮，獲得玉米外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳4 個(gè)部分，為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，用于本部分實(shí)驗(yàn)的胚芽與胚乳輔以手工剝離收集。獲得的4 個(gè)不同部位的玉米樣品及玉米全籽粒樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎、過(guò)20 目篩，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基本組分測(cè)定

分別采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[14]、GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測(cè)定》[15]、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[16]、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》[17]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》[18]、GB/T 5009.10—2003《植物類(lèi)食品中粗纖維的測(cè)定》[19]中的方法測(cè)定各部分玉米樣品的水分、總淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分及粗纖維含量。

1.3.3 玉米特征性成分的提取與測(cè)定

參考Ndolo等[20]的方法對(duì)樣品中類(lèi)胡蘿卜素進(jìn)行提取并測(cè)定其組成。

1.3.3.1 類(lèi)胡蘿卜素的提取

分別取玉米全籽粒、外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳樣品各500 mg與5 mL水飽和正丁醇混合，旋渦振蕩混勻后密封置于通風(fēng)櫥中振蕩提取15 min，于室溫下暗處?kù)o置60 min，重復(fù)上述振蕩-靜置提取操作2 次。于室溫下4000 r/min離心5 min，合并上清液，旋蒸干燥。用甲醇定容至50 mL，進(jìn)行抽濾，隨后將獲得的樣品避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別將β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品與甲醇混合制備成質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，等體積配制成混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。利用高效液相色譜測(cè)定單組分標(biāo)準(zhǔn)樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，依據(jù)各單組分標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間確定混合標(biāo)準(zhǔn)樣品中各組分。使用甲醇將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品分別稀釋為原質(zhì)量濃度的4/5、3/5、2/5、1/5和1/10，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對(duì)峰面積（y）對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.3.3.3 總類(lèi)胡蘿卜素的測(cè)定

使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定1.3.3.1節(jié)中提取得到樣品的吸光度，以β-胡蘿卜素作為參考，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總類(lèi)胡蘿卜素含量。

1.3.3.4 高效液相色譜測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素的組成

使用高效液相色譜測(cè)定1.3.3.1節(jié)中提取得到樣品中葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及β-隱黃質(zhì)的含量。色譜條件為：YMC Carotenoid S-3色譜柱（4.6 mm×100 mm，3 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：A為甲醇∶MTBE∶超純水＝81∶15∶4（V/V），B為MTBE∶甲醇＝90∶10（V/V）；流速1 mL/min；梯度洗脫程序：0～9 min，100%～75% A、0%～25% B；10～12 min，0% A、100% B；12～13 m i n，0%～100% A、100%～0% B；13～15 min，100% A、0% B；采用光電二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。

1.3.4 酚類(lèi)物質(zhì)的提取與測(cè)定

1.3.4.1 游離酚及結(jié)合酚的提取

參考梁潤(rùn)平等[21]的方法并稍作改動(dòng)。分別取玉米全籽粒、外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳樣品各1 g于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇，旋渦振蕩1 min，功率100 W下超聲處理1 h。10000 r/min離心10 min，分離有機(jī)相，重復(fù)提取操作2 次，合并3 次有機(jī)相。40 ℃旋蒸干燥，加入2 mL色譜純甲醇復(fù)溶，抽濾后得到游離酚提取物，置于-20 ℃避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

向游離酚提取后的沉淀物中加入20 mL 2 mol/L NaOH溶液，室溫避光下振蕩消化1 h，用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系至pH 2～3，加入等體積的正己烷脫脂，脫脂后用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)乙酸乙酯萃取共5 次，合并有機(jī)相。從常溫逐步升溫至45 ℃旋蒸干燥，殘余物用甲醇定容至10 mL，得到結(jié)合酚提取物，置于-20 ℃避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 游離酚和結(jié)合酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu比色法進(jìn)行測(cè)定。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：向10 mL棕色容量瓶中分別加入100 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，加水稀釋至6.0 mL，隨后分別加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑、3 mL 75 g/L Na2CO3溶液，混勻加水定容后避光放置60 min。在760 nm波長(zhǎng)處對(duì)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行比色測(cè)定，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取0.1 mL提取物于10 mL棕色容量瓶中，按上述步驟進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離酚和結(jié)合酚的含量，總酚含量為游離酚含量與結(jié)合酚含量之和，結(jié)果以每100 g玉米樣品中所含沒(méi)食子酸當(dāng)量表示（mg/100 g）。

1.3.4.3 游離黃酮和結(jié)合黃酮含量的測(cè)定

采取NaNO2-Al(NO)3方法測(cè)定。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：向10 mL棕色容量瓶中分別加入100 μg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，加水稀釋至3 mL，依次加入0.15 mL 50 g/L NaNO2溶液反應(yīng)5 min，加入0.15 mL 100 g/L AlCl3·6H2O溶液混合反應(yīng)5 min。再向混合液中加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液反應(yīng)15 min，蒸餾水定容至10 mL混勻備用。樣品測(cè)定：向1 mL酚類(lèi)物質(zhì)提取物中加入1.5 mL蒸餾水，按照上述方法依次加入NaNO2溶液、AlCl3·6H2O溶液和NaOH溶液，充分反應(yīng)后，蒸餾水定容至10 mL混勻備用。于415 nm波長(zhǎng)處對(duì)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離黃酮和結(jié)合黃酮的含量，總黃酮含量為游離黃酮含量與結(jié)合黃酮含量之和，結(jié)果以每100 g玉米樣品中所含兒茶素當(dāng)量表示（mg/100 g）。

1.3.4.4 單體特征酚的測(cè)定

參考柴多等[22]的方法并略作修改。超高效液相色譜條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相：A為甲酸∶水＝0.1∶100（V/V），B為甲酸∶乙腈＝0.1∶100（V/V）；流速300 μL/min。梯度洗脫程序：0～2 min，95% A、5% B；2～20 min，95%～55%A、5%～45% B；21～32 min，100% A、0% B。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負(fù)離子全掃描模式；離子源干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓強(qiáng)40 psi；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細(xì)管裂解電壓-3.5 kV；毛細(xì)管出口電壓135 V；碰撞能量（30±5）eV；掃描范圍m/z100～1000。

根據(jù)已報(bào)道[3,5-6]的玉米中酚類(lèi)物質(zhì)含量分別配制梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)峰面積（y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.3.5 玉米籽粒不同部位抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 樣品提取液制備

參考包怡紅等[9]的方法并略作修改。分別取玉米全籽粒、外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳樣品各2 g，以甲醇溶液為溶劑、按照固液比1∶20（g/mL）混合，超聲處理1 h（500 W，50 ℃）。4000 r/min離心10 min，收集上清液。重復(fù)上述操作2 次，合并上清液。旋蒸干燥后用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇溶液定容至50 mL，得到待測(cè)樣品，置于4 ℃避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定

參考梁潤(rùn)平等[21]的方法并略作修改。取1 mL待測(cè)樣品與3 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基甲醇溶液混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以3 mL DPPH自由基甲醇溶液作為空白組，1 mL樣品溶液與3 mL甲醇溶液混合作為對(duì)照組。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.5.3 鐵離子還原能力測(cè)定

FRAP溶液的制備：將pH 3.80.3 mol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ工作液及20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1（V/V）混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。取待測(cè)樣品50 μL，加入200 μL FRAP工作液，混勻后37 ℃下反應(yīng)10 min，于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以不加樣品的體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇溶液作為對(duì)照。按下式計(jì)算鐵離子還原能力：

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MassHunter Workstation B.06.00軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性定量分析：以軟件及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中各化合物的保留時(shí)間、兩對(duì)離子對(duì)及相對(duì)比例進(jìn)行定性；以定量離子對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒不同部位的特征性成分分析

實(shí)驗(yàn)獲得的玉米外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳4 個(gè)部分得率分別為7.07%、7.21%、10.65%和68.40%。得到的玉米外皮層中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10.65±0.02）%、總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（13.48±0.91）%、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.57±0.42）%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.02±0.28）%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.65±0.06）%、粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)（39.35±1.38）%；內(nèi)皮層中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（12.86±0.12）%、總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（29.16±1.47）%、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（9.17±2.10）%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.97±0.34）%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1.70±0.18）%、粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)（28.90±1.29）%。對(duì)照Serna-Saldivar[10]的研究，玉米外皮層部分主要由玉米果皮、交叉細(xì)胞、管細(xì)胞以及部分種皮構(gòu)成，內(nèi)皮層部分主要由玉米種皮、糊粉層及部分外胚乳構(gòu)成。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）對(duì)玉米籽粒不同部位的特征性成分進(jìn)行了定量分析。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)用玉米全籽粒中總類(lèi)胡蘿卜素含量為37.53 mg/kg，接近國(guó)內(nèi)報(bào)道的“京甜5號(hào)”（39.68 mg/kg）等鮮食玉米品種[9]，略高于國(guó)外報(bào)道的黃玉米（19.3～26.4 mg/kg）[23]。這可能是因?yàn)橛衩字羞€存在其他可導(dǎo)致黃色的未知色素成分，而使用比色法計(jì)算總類(lèi)胡蘿卜素的含量時(shí)無(wú)法排除這些未知色素的影響[24]。比較來(lái)看，總類(lèi)胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)在胚乳及內(nèi)皮層中含量高于胚芽，玉米特征性成分在外皮層中的含量最少。總類(lèi)胡蘿卜素含量在胚乳、內(nèi)皮層及胚芽中分別為44.36、33.05 mg/kg和18.62 mg/kg，結(jié)合3 個(gè)部分在玉米籽粒中的占比，胚乳、內(nèi)皮層和胚芽對(duì)整個(gè)玉米籽粒總類(lèi)胡蘿卜素的貢獻(xiàn)分別約為80.84%、6.35%和5.28%，與文獻(xiàn)報(bào)道接近[20]。但在相關(guān)文獻(xiàn)中，胚乳對(duì)玉米籽粒總類(lèi)胡蘿卜素含量的貢獻(xiàn)占比更高，可達(dá)90%～107%，而玉米皮及胚芽的貢獻(xiàn)則分別約為4.3%和1.4%[20]。可能的原因是玉米中的有色特征性組分主要存在于糊粉層和外胚乳，而在分層剝皮得到的分離部位中，糊粉層和部分外胚乳存在于內(nèi)皮層中，剩余的外胚乳與淀粉質(zhì)胚乳保存于胚乳部位。由表2可知，玉米籽粒不同部位中β-胡蘿卜素含量在內(nèi)皮層中含量最高，為1.08 mg/kg，胚乳、胚芽次之。

表1 類(lèi)胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves for quantification of carotenoids

表2 玉米籽粒不同部位的特征性成分含量Table 2 Contents of characteristic components in different parts of corn kernel mg/kg

玉米中的類(lèi)胡蘿卜素多為極性類(lèi)胡蘿卜素，如葉黃素和玉米黃質(zhì)等。如圖1所示，4 個(gè)主要的峰分別為葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素。由表2可知，玉米全籽粒中的類(lèi)胡蘿卜素主要以玉米黃質(zhì)為主（占比約為30.24%），其次為葉黃素和β-隱黃質(zhì)（占比分別約為14.79%和14.55%），β-胡蘿卜素的相對(duì)含量略少（約為2.40%），這與此前報(bào)道的研究結(jié)果一致[20,25]。玉米不同部位中不同種類(lèi)類(lèi)胡蘿卜素的含量存在一定差異：內(nèi)皮層中玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素的含量顯著高于其他部位（P＜0.05）；葉黃素主要富集于胚乳部位。胚乳中玉米黃質(zhì)和葉黃素含量較高，占比分別為22.02%和14.52%；胚芽中玉米黃質(zhì)、葉黃素含量較高，β-隱黃質(zhì)含量次之，分別占比約為29.91%、21.70%和14.93%；內(nèi)皮層中的玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和葉黃素占比分別約為33.13%、13.07%和11.59%；外皮層中玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和葉黃素的占比則分別為14.75%、8.23%和6.69%。β-胡蘿卜素在4 個(gè)部分中的類(lèi)胡蘿卜素中占比均不高，在1.92%～4.46%之間。根據(jù)洗脫順序及光譜吸收最大值，圖1中一些未被標(biāo)記的峰可能是葉黃素及玉米黃質(zhì)的順式異構(gòu)體[26]。

圖1 玉米籽粒不同部位分離的特征性成分及標(biāo)準(zhǔn)品混合物液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of carotenoids separated from different parts of corn kernel and standard mixture

2.2 玉米籽粒不同部位的酚類(lèi)物質(zhì)含量分析

玉米籽粒是具有抗氧化活性作用的酚類(lèi)物質(zhì)的重要來(lái)源[27]。酚類(lèi)物質(zhì)通過(guò)提供氫離子或電子，可捕獲自由基，通過(guò)螯合陽(yáng)離子清除體內(nèi)自由基。一些種類(lèi)的酚酸可以結(jié)合過(guò)渡金屬，作為過(guò)氧化反應(yīng)酶抑制劑，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體提供保護(hù)[28]。如表3所示，玉米籽粒不同部位的游離酚、結(jié)合酚以及總酚含量分別具有顯著差異（P＜0.05）。玉米全籽粒中總酚含量為248.61 mg/100 g，與相關(guān)報(bào)道中的結(jié)果接近[29]，其中游離酚占總酚含量的17.42%。玉米外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳部位的總酚含量分別為1321.85、1088.75、278.21 mg/100 g和30.08 mg/100 g，說(shuō)明玉米酚類(lèi)物質(zhì)多存在于玉米皮層及糊粉層中，在胚乳中含量很少。玉米中的酚類(lèi)物質(zhì)多以結(jié)合態(tài)存在，游離酚在玉米外皮層、內(nèi)皮層部位的總酚含量中占比分別為16.66%和20.92%，說(shuō)明內(nèi)皮層中含有相對(duì)較多的以游離態(tài)存在的酚類(lèi)物質(zhì)，如游離酚和可溶性共軛酚，后者可能繼續(xù)被氧化從而為總酚含量及抗氧化活性產(chǎn)生一定貢獻(xiàn)[30]。

由表3可知，玉米中的黃酮類(lèi)物質(zhì)，多以結(jié)合態(tài)存在，因其貢獻(xiàn)比例高，不同部位總黃酮含量與結(jié)合黃酮變化趨勢(shì)一致。玉米外皮層和內(nèi)皮層中的總黃酮含量顯著高于胚芽、胚乳以及全籽粒（P＜0.05）。玉米外皮層和內(nèi)皮層間總黃酮含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），均在2300 mg/100 g左右，二者的游離黃酮及結(jié)合黃酮含量也均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 玉米籽粒不同部位的酚類(lèi)物質(zhì)含量Table 3 Contents of phenolic components in different parts of corn kernel mg/100 g

酚類(lèi)物質(zhì)是具有一個(gè)或多個(gè)羥基的化合物[31]。酚酸可被分為羥基苯甲酸衍生物和羥基肉桂酸衍生物兩大類(lèi)，其中羥基苯甲酸衍生物包括對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸和沒(méi)食子酸等，是木質(zhì)素和可水解單寧等的重要組成部分，多以結(jié)合態(tài)存在；羥基肉桂酸衍生物主要包括咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等，可通過(guò)酯鍵與纖維素、木質(zhì)素等細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相連接[32-33]。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（表4）對(duì)玉米籽粒不同部位的單體酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，表5中所列的17 種酚類(lèi)物質(zhì)在玉米各個(gè)部位均有檢出，其中含量較高的特征酚包括香草醛、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、丁香醛及對(duì)羥基肉桂酸，與Prasanthi等[27]的研究結(jié)果接近。香草醛、對(duì)羥基苯甲酸在玉米全籽粒、外皮層、內(nèi)皮層中均約占該部位單體特征酚總量的33%左右，在胚芽和胚乳部分略低，分別占比約25%和28%；丁香醛在各部位的含量均約占該部位單體特征酚總含量的6%～8%。阿魏酸在玉米中含量較為豐富，其中大部分存在于玉米皮和糊粉層中，在胚乳中的含量較少[34]。阿魏酸可通過(guò)共價(jià)鍵與細(xì)胞壁組織中的阿拉伯木聚糖結(jié)合，形成結(jié)合態(tài)阿魏酸。根據(jù)Adom等[4]的報(bào)道，玉米中游離態(tài)、可溶性結(jié)合態(tài)、結(jié)合態(tài)阿魏酸的比例分別約為0.6%、7%和93%，這些結(jié)合態(tài)的阿魏酸一方面可能賦予玉米多糖一定的抗氧化活性，另一方面可能在加工過(guò)程中被釋放，以提高加工產(chǎn)品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物可利用率[29,35]。

表4 單體酚類(lèi)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 4 Standard curves for quantification of phenolic compounds

表5 玉米籽粒不同部位的單體特征酚含量Table 5 Contents of individual phenolic acids in different parts of corn kernel mg/100 g

2.3 玉米籽粒不同部位的抗氧化活性分析

如圖2所示，玉米外皮層和內(nèi)皮層的DPPH自由基清除能力顯著高于胚芽和胚乳部位（P＜0.05），前兩者分別約為后兩者的4～5 倍。各部位樣品在不同指標(biāo)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的抗氧化活性強(qiáng)弱存在一定差異，但總體變化趨勢(shì)相似。由圖2可知，內(nèi)皮層的鐵還原能力相對(duì)較好，除胚乳部位顯著較低外（P＜0.05），其他各組無(wú)顯著差異。

圖2 玉米籽粒不同部位的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activities of different parts of corn kernel

2.4 玉米特征性成分及酚類(lèi)物質(zhì)與籽粒不同部位抗氧化活性的相關(guān)性分析

對(duì)類(lèi)胡蘿卜素及酚類(lèi)物質(zhì)與抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，確定玉米籽粒中抗氧化活性的主要有效成分。如圖3A所示，玉米籽粒的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力與總酚、游離酚、結(jié)合酚、總黃酮、游離黃酮和結(jié)合黃酮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總類(lèi)胡蘿卜素含量未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性（P＞0.05），說(shuō)明玉米籽粒的抗氧化活性與酚類(lèi)物質(zhì)含量高度相關(guān)。由圖3B可知，單體特征酚對(duì)玉米籽粒抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)來(lái)自于香草醛、對(duì)羥基苯甲酸和丁香醛，上述3 個(gè)特征酚類(lèi)物質(zhì)與玉米籽粒DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；此外，丁香醛酸和沒(méi)食子酸與DPPH自由基清除能力分別呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）和顯著正相關(guān)（P＜0.05），沒(méi)食子酸和咖啡酸與鐵離子還原能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；阿魏酸是除上述提到的組分外，與酚類(lèi)物質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)的組分（P＜0.01），但其與抗氧化活性的相關(guān)性并不顯著（P＞0.05）。

圖3 玉米籽粒活性物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between phytochemicals and antioxidant activities of corn kernel

3 結(jié)論

基于玉米分層剝皮技術(shù)，結(jié)合靶向代謝組學(xué)檢測(cè)方法，分析了分離得到的玉米外皮層、內(nèi)皮層、胚芽和胚乳中類(lèi)胡蘿卜素等玉米特征性成分及酚類(lèi)物質(zhì)等次生代謝物質(zhì)的主要組分與含量，并明確了其與抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果表明，類(lèi)胡蘿卜素主要存在于玉米籽粒的糊粉層和外胚乳中，4 個(gè)主要組分包括玉米黃質(zhì)、葉黃素、β-隱黃質(zhì)及β-胡蘿卜素，其中，除葉黃素主要富集于胚乳部位外，其他3 個(gè)主要組分多存在于內(nèi)皮層部位。玉米籽粒不同部位的游離酚、結(jié)合酚以及總酚含量分別具有顯著差異（P＜0.05），總黃酮含量與結(jié)合黃酮變化趨勢(shì)一致，主要以結(jié)合態(tài)形式存在于果皮、種皮及糊粉層中。玉米籽粒各部位共檢出單體特征酚17 種，其中香草醛、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸等含量較高。各部位樣品在不同指標(biāo)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的抗氧化活性存在一定差異，但總體變化趨勢(shì)相似，玉米內(nèi)皮層和外皮層部位的抗氧化能力相對(duì)更高。玉米的抗氧化活性與其酚類(lèi)物質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），單體特征酚對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)主要來(lái)自于香草醛、對(duì)羥基苯甲酸和丁香醛。綜上，玉米內(nèi)皮層部位，主要由玉米種皮及糊粉層構(gòu)成，具有相對(duì)較高的活性物質(zhì)含量、更好的抗氧化活性。本研究可為增加玉米加工產(chǎn)品附加價(jià)值、提高玉米原料綜合利用率提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。