林恒宗,梁志源,秦小明,高加龍,范秀萍,黃艷平,常向陽,鄧 杰,吳煒俊
(廣東海洋大學食品科技學院,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),廣東省水產品加工與安全重點實驗室,水產品深加工廣東普通高校重點實驗室,廣東 湛江 524088)
牡蠣為我國重要的經濟貝類,2020年總產量約為542萬 t,約占貝類總產量的1/3[1]。鮮活牡蠣由于其肉質爽滑、味道鮮甜,且富含蛋白質、牛磺酸、糖原及微量元素等營養物質而深受消費者青睞,因此在我國牡蠣主要以鮮銷生食為主[2-3]。牡蠣采捕離水后需歷經運輸、凈化、保活、銷售等商業流通環節,然而牡蠣在各流通環節均會受到環境脅迫應激如:缺氧、干露、振蕩、饑餓、溫度波動等,隨著流通時間的延長,機體組織臟器受到不同程度的損傷,存活質量也受到顯著影響[4],因此如何將高品質鮮活牡蠣運輸至內地市場已經成為行業研究熱點。近年來,國內外針對活體牡蠣運輸的研究取得了一定的經濟和社會效益,如:香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)[5]在生態冰溫條件下保活9 d,其存活率高達90%。但產業實際中判斷牡蠣活力及品質劣變的方法僅能依靠開殼、敲擊、嗅聞等傳統經驗手段,難以全面反映牡蠣流通過程中活力及整體品質。
活體牡蠣具有獨特的海洋鮮香氣味,在流通過程中香氣會隨著時間的延長、環境的改變而發生變化,因此風味降解是鑒別牡蠣活力品質變化的關鍵途徑。近年來,氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯用技術被廣泛應用于食品揮發性風味成分分析[6-8],目前該技術在活體貝類凈化及保活流通中已有相關報道,如:冉云等[9]采用GC-MS技術,明確了縊蟶(Sinonovacula constricta)暫養凈化8 h可明顯降低其不良氣味;張思嘉等[10]采用相同方法探究凈化對美洲簾蛤(Mercenaria mercenaria)風味成分的影響也得出類似結果;傅潤澤等[11]研究表明,蝦夷扇貝(Patinopecten yessonensis)在保活運輸后其揮發性風味物質與采捕后相比具有明顯差異;然而鮮見該技術應用于活體牡蠣商業流通過程中風味品質監控的研究。因此,本研究模擬當前國內活體太平洋牡蠣流通模式,采用GC-MS聯用法以鑒定活體太平洋牡蠣中揮發性風味物質種類及含量,分析流通各環節風味物質變化規律,探明各流通環節間內在聯系,以期建立一種鑒別活體太平洋牡蠣品質狀態的方法。
活體太平洋牡蠣于2021年10月購自山東威海燈塔水母海洋科技有限公司,規格為(129.51±2.81)g/個,殼長(127.62±2.07)mm,殼寬(64.11±3.57)mm,殼高(31.98±2.47)mm。牡蠣采捕后保留外殼附著物,每50 kg分裝于鋪有海水冰的泡沫箱內,經專用冷鏈運輸車低溫運輸48 h抵達廣東海洋大學保活流通實驗室,剔除活力弱或死亡的個體,立即用滅菌人工海水清洗表面泥污后進行暫養凈化,以消除捕撈或運輸操作時應激脅迫。
海水晶 江西鹽通科技有限公司;2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-trimethylpyridine,TMP) 上海安譜有限公司;其余試劑均為國產分析純。
貝類暫養凈化系統 廣州創嶺水產有限公司;YC-800低溫恒溫層析柜 北京亞星儀科公司;SPX-250B生化培養箱 上海博迅公司;PR224ZH精密天平美國OHAUS公司;5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;8-2T恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦有限公司;PB-10 pH計、57330-U固相微萃取裝置、50/30 μm-57348-U型-DVB/CAR/PDMS固相微萃取針 德國Supelco公司;7890A-5975C GC-MS聯用儀、HP-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國Agilent公司。
1.3.1 牡蠣凈化
凈化流程及方法參照SC/T 3013—2002《貝類凈化技術規范》,在貝類凈化系統中按太平洋牡蠣養殖海域鹽度((31±0.5)‰)配制人工海水,開啟增氧設備持續曝氣24 h,以流速2.5 m3/h通過紫外燈管循環滅菌制冷至25 ℃,通臭氧至海水臭氧質量濃度0.15 mg/L,將清洗后的牡蠣分裝于塑料筐(600 mm×420 mm×315 mm),置于預冷的循環人工海水中凈化24 h,暫養期間不投喂餌料,保持水體溶解氧不小于8 mg/L,凈化完成后挑選富有活力的個體進行下一步實驗。
1.3.2 誘導休眠及生態冰溫保活
參照本團隊前期實驗方法[4],將暫養凈化后的牡蠣采用聚氯乙烯熱收縮膜逐個包裹,包裝完成后將牡蠣分裝于塑料周轉筐中(600 mm×420 mm×315 mm),轉移至低溫恒溫層析柜誘導休眠處理,處理方式為調節恒溫層析柜,從(25±0.5)℃開始,以5 ℃/h的速率降至生態冰溫休眠溫度0 ℃,溫度每下降5 ℃停留90 min,避免溫度急劇下降造成應激損傷。誘導休眠結束后,迅速將牡蠣分裝于套有內膜袋的泡沫箱(450 mm×250 mm×200 mm)中,裝箱前在箱底平鋪一層無菌海水制備而成的冰袋,逐層覆蓋浸足滅菌海水的海綿保濕處理,加蓋后放置在溫度設定為0 ℃的層析柜中進行無水保活。
1.3.3 樣品采集與制備
實驗分別在凈化前、凈化后、休眠后、保活3 d、保活6 d、保活9 d取樣,每組隨機取活體牡蠣60 只,迅速開殼刨取牡蠣全臟器,用預冷質量分數為0.86%生理鹽水漂洗,吸水紙拭干表面水分,冰浴高速混合勻漿成肉糜狀,立即使用或液氮速凍后置于-80 ℃凍存。
1.3.4 揮發性氣味成分分析
1.3.4.1 萃取方法
參照Van Houcke等[8]萃取方法并加以改進,精確稱取5.000 g牡蠣勻漿肉糜置于20 mL頂空瓶內,頂空瓶內注入10 μL質量濃度為50 μg/mL的TMP作為內標物,密封,置于85 ℃水浴中磁力攪拌(轉速500 r/min)平衡20 min,萃取針在GC進樣口250 ℃活化20 min后插入頂空瓶內萃取30 min。
1.3.4.2 GC-MS條件
GC條件:采用不分流進樣模式,HP-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);初始溫度50 ℃,保持3 min;隨后分別以5、4 ℃/min和4 ℃/min的速率升溫至100、140、180 ℃,并在終溫處分別保持2、1 min和2 min,最后以5 ℃/min升至250 ℃,保留5 min;高純度氦氣作為載氣;流速1.5 mL/min;進樣口溫度250 ℃。
MS條件:采用電子電離模式;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;接口溫度250 ℃;全掃描m/z35~550。
1.3.4.3 定性分析
根據GC-MS得出的太平洋牡蠣揮發性香氣化合物的質譜信息,與NIST和Wiley譜庫對比,輔助人工圖譜解析,選擇正反向匹配值均大于800的化合物進行定性分析,各化合物峰面積由儀器軟件計算。
1.3.4.4 定量分析
采用內標法進行半定量分析[12],根據已知濃度的TMP峰面積計算出不同實驗組牡蠣組織樣品中各揮發性風味物質的含量,按式(1)計算:

式中:Ci為目標化合物的含量/(ng/g);Ax為目標化合物的峰面積;Ai為內標化合物TMP的峰面積;Cx為內標化合物的含量/(ng/g)。
1.3.4.5 關鍵揮發性風味物質的分析
參照Feng Yunzi等[13]方法及相關文獻揮發性風味物質的閾值,以香氣活性值(odor activity value,OAV)對樣品中起關鍵作用的揮發性物質進行確定,按式(2)計算OAV:

式中:Ci為目標化合物的質量含量/(ng/g);Ct為該物質的感覺閾值/(ng/g)。
采用頂空固相萃取結合GC-MS測定,通過NIST/Wiley數據庫匹配,鮮活太平洋牡蠣共鑒定出7大類、49 種揮發性風味化合物(表1、圖1),其中醛類15 種、酯類14 種、烷烴類5 種、雜環化合物4 種、酮類4 種、醇類3 種、芳香族化合物2 種以及其他化合物2 種。可見,醛、酯類化合物為活體太平洋牡蠣中含量最豐富的揮發性風味物質,在葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)[14]、歐洲扁牡蠣(Ostrea edulis)[8]中也發現類似結果。由圖1可知,太平洋牡蠣采捕離水后在不同流通階段揮發性風味物質的種類和含量均發生不同的變化。凈化前牡蠣共鑒定出31 種揮發性風味物質,醛類15 種,含量為700.86 ng/g;酯類6 種,含量為726.74 ng/g;酮類3 種,含量為91.8 ng/g。復水凈化后,醛、脂類化合物各減少1 種,含量分別下降了64.25%、46.73%;酮類化合物減少1 種,含量下降了36.49%。誘導休眠至保活流通終期揮發性風味物質種類及含量大體呈上升趨勢,保活9 d后,酯類化合物較凈化前增加了8 種,含量為凈化前的4.56 倍;醛酮類化合物減少各減少2 種,其中醛類化合物增加了19.9%,酮類化合物則下降了39.9%;同時雜環及烴類物質分別增加1~2 種。以上結果顯示,活體太平洋牡蠣采捕后不同流通階段揮發性風味化合物差異明顯,但要確定各階段風味物質具體含量變化仍需進一步分析。

圖1 太平洋牡蠣不同流通階段揮發性風味物質含量(a)、種類個數(b)變化Fig.1 Changes in contents (a) and types of flavor substances (b) of C.gigas during different circulation stages
為解析太平洋牡蠣在不同流通階段揮發性風味成分變化,首先將化合物按官能團分類,并通過相關文獻對其氣味特征進行描述(表1)。大量研究表明,揮發性醛類化合物為鮮活太平洋牡蠣主要香氣來源[15],本研究同樣發現醛類物質在活體太平洋牡蠣中占主導地位,這可能與牡蠣生長環境及攝食密切相關。暫養凈化期間庚醛、壬醛、月桂醛、己醛、十三醛、十一醛、苯甲醛、癸醛等直鏈飽和醛的含量與凈化前相比有所下降,但無顯著差異(P>0.05),這些醛類化合物是脂質氧化的降解產物,其中壬醛是油酸和亞油酸氧化的產物,多具有塑料味、魚腥味[14];己醛、癸醛、庚醛會產生刺鼻的油脂氧化氣味[14];苯甲醛具有苦味和焦糖類似味,被認為是苯丙氨酸Strecker反應降解的產物。冉云等[9]研究表明,縊蟶體內泥土味、腥臭味、糞便味等不良風味主要來源于直鏈飽和醛,這也證實了牡蠣通過暫養凈化能緩解捕撈或運輸操作時應激脅迫導致的脂質氧化損傷,保留其獨特風味的同時可降低其不良氣味使牡蠣更加適口。(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等不飽和醛類較凈化前同樣有所下降,其中(E)-2-壬烯醛降幅更為明顯(P<0.05),Aruna等[16]研究發現,這些產物多為脂肪酸氧化降解產物,推測太平洋牡蠣采捕后長時間暴露于空氣中體內多不飽和脂肪酸氧化速率加快,復水后其脅迫解除,活力恢復,緩解了脂質氧化進一步加劇,體內揮發性氣味物質得以再次積累,呈現出濃烈的清香氣味。牡蠣在誘導休眠后醛類化合物含量呈明顯上升趨勢;之后隨著保活時間的延長,含量變化與保活時間呈正相關。推測牡蠣長時處于低溫脅迫狀態,導致肌肉細胞內生物大分子氧化損傷,肌肉脂質、游離脂肪酸發生初始氧化損傷,其降解產物為醛類化合物,同時也是貝類鮮甜香氣的主要來源[17]。保活9 d后,活體牡蠣組織中庚醛、壬醛、苯甲醛等14 種醛類明顯高于凈化后水平(P<0.05),可見無水保活有利于提升牡蠣整體風味。

表1 太平洋牡蠣流通過程中揮發性風味物質含量變化Table 1 Changes of volatile flavor substances in C.gigas during circulation stages
酯類香氣化合物主要呈奶油香、水果香、花香、甜味、青草味等愉悅性氣味[18],鮮活太平洋牡蠣檢測出肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、壬烯酸甲酯、十七酸甲酯等14 種酯類,其中棕櫚酸甲酯在保活第9天其含量高達1264.76 ng/g。這些酯類大多為牡蠣組織中未經甲酯化處理的脂肪酸與不飽和脂肪酸,其不僅可以作為能源抵御不良環境變化,同時也是牡蠣中鮮、香氣味的主要來源[19]。牡蠣在復水凈化后肉豆蔻酸甲酯、十五碳酸甲酯、十六烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯較凈化前明顯下降(P<0.05),可見牡蠣采捕離水后,干露、缺氧脅迫致使脂質發生了初級氧化,復水凈化后牡蠣活力恢復,緩解了脂肪氧化進一步加劇,同時牡蠣處于饑餓脅迫狀態需消耗脂肪酸以維持的正常生命代謝活動。誘導休眠至保活流通終期,肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、十六烯酸甲酯、亞油酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯等酯類物質隨運輸時間的延長呈上升趨勢(P<0.05),提示低溫運輸脅迫導致牡蠣肌肉組織脂質氧化加劇,然而這些化合物多為牡蠣中的不飽和脂肪酸,其賦予牡蠣獨特脂肪清香氣味,保活9 d后活體牡蠣組織中仍檢測出二十碳五烯酸等人體所需的酯類化合物大量存在,可見牡蠣在長時無水流通過程中整體風味及營養物質未發生改變。在已有的研究中,吳梓宣等[20]研究表明,蝦夷扇貝在暫養凈化過程中,隨著凈化時間的延長其多不飽和脂肪酸呈下降趨勢。Fan Xiuping等[21]研究發現,珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelus fuscoguttatus×♂E.lanceolatus)在無水保活過程中二十碳五烯酸甲酯呈下降趨勢,與本研究結果相似。
烷烴類、酚類、含硫等雜環類揮發性風味物質在各不同流通階段的牡蠣中檢出較少,烷烴類物質的產生主要來源于脂肪酸烷氧自由基斷裂,含氮含硫及雜環化合物主要由蛋白質在微生物和酶的作用下分解產生,酚類物質則可能來自環境中的污染物[22]。在本研究中,活體牡蠣鑒定出十六烷、2-乙基呋喃、2-戊基呋喃、二甲基硫醚等活貝中具有代表性的關鍵氣味物質,其中2-乙基呋喃、2-戊基呋喃具有很強的肉香味;二甲基硫醚則由氨基酸降解產生,是牡蠣中最重要的香氣揮發物[11,23]。牡蠣在暫養凈化后十六烷、2-乙基呋喃較凈化前有所提升,研究表明,采捕后未經凈化的活貝腸道中含有大量未排出的糞便、泥沙等雜質,這些殘留物通常被認為是不良口感及腥臭味的主要來源[9],可見通過暫養凈化牡蠣愉悅性風味得到明顯改善。隨著保活時間的延長,2-乙基呋喃、2-戊基呋喃、二甲基硫醚較凈化后顯著提升(P<0.05),同時吲哚類化合物緩慢增加,牡蠣組織整體香氣含量呈積聚趨勢,這一現象在活體蝦夷扇貝[11]流通過程中也有報道,提示在長時低溫流通過程中牡蠣生理狀態變差,風味品質也受到一定的影響,但由于這幾類化合物閾值較高,對牡蠣氣味作用不顯著。
酮類化合物在牡蠣等海洋貝類中主要貢獻青草香、脂肪香、花香、果香風味,是脂肪氧化及氨基酸降解產物,本研究中活體牡蠣鑒定出2-壬酮、3,5-辛二烯-2-酮、3-辛酮、(E)-3,5-辛二烯-2-酮4 種化合物;其中2-壬酮已被鑒定為活體牡蠣中主要呈鮮味化合物[24]。酮類化合物含量變化與醛類物質呈負相關,在流通過程中整體呈波動下降趨勢,其中3,5-辛二烯-2-酮、3-辛酮與凈化后相比具有明顯差異(P<0.05),這可能是流通過程中微生物快速增長,代謝活動需分解羥基類化合物,從而導致風味品質逐漸下降。醇類化合物主要由脂肪氧合酶和氫過氧化酶降解亞油酸產生,其風味閾值遠高于醛酮類化合物,對牡蠣整體風味貢獻較小,但一些不飽和醇的閾值較低,對牡蠣的整體風味有一定貢獻。如:十六烷醇、7-十四烷醇、1-戊烯-3-醇,這幾類物質通常具有植物芳香氣味,在凈化前后均能檢出,但隨著流通時間的延長,脂質氧化作用導致這些化合物發生明顯的積聚。
為直觀區分太平洋牡蠣在不同流通階段揮發性香氣物質的差異,將各流通階段香氣化合物含量進行熱圖聚類分析,結果如圖2所示。49 種化合物可聚類為4 類,其中香氣化合物A類>B類>C類>D類,活體太平洋牡蠣不同流通階段香氣化合物差異最為顯著的是A、B類化合物,包括十六烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯、己醛、3-辛酮、2-乙基呋喃等醛、酯物質。由樣品聚類分析結果可以看出,凈化前與凈化后組牡蠣在最小距離水平首先發生聚類,表明牡蠣在凈化前與凈化后揮發性物質組成與含量相似性較高,這說明太平洋牡蠣在采捕離水后通過暫養凈化機體呈現出明顯的恢復性,對其風味具有明顯改善作用;在保活流通階段,休眠組與保活第6天首先發生聚類,隨著歐式距離的增加與保活第3、9天聚為另一大類;表明隨著保活時間的延長,牡蠣體內揮發性物質含量發生明顯改變。鮮活牡蠣鑒定出揮發性風味化合物種類較多,為明確牡蠣各流通階段關鍵風味物質及含量變化仍需采用OAV進行篩選分析。

圖2 太平洋牡蠣不同流通階段揮發性風味物質含量變化熱圖Fig.2 Heatmap of changes in volatile flavor substances of C.gigas during circulation stages
為進一步明確各不同流通階段太平洋牡蠣關鍵風味物質及其含量變化,依據牡蠣風味化合物的組成及其閾值,采用OAV評價方法以客觀反映每種揮發性化合物對牡蠣總香氣的貢獻。一般認為,OAV不小于1的物質是影響樣品關鍵風味化合物,且OAV越大則對樣品香氣貢獻程度越高[25]。由表2可知,揮發性香氣化合物以醛酮類為主,因而確定醛酮類化合物為活體太平洋牡蠣中關鍵香氣成分;太平洋牡蠣在各不同流通階段OAV不大于1的物質共有5 種,分別為苯甲醛、(E)-3,5-辛二烯-2-酮、3,5-辛二烯-2-酮、2-乙基呋喃、1-戊烯-3-醇,說明其對牡蠣總體風味具有修飾作用;OAV不小于1的物質有13 種,分別為己醛、庚醛、十一醛、(E)-2-壬烯醛、4-乙基苯甲醛、壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、癸醛、(E)-2-辛烯醛、2-戊基呋喃、3-辛酮、2-壬酮,表明這些揮發性化合物為活體牡蠣流通過程中起主要貢獻的風味物質,其中己醛(青香味)、癸醛(脂味、海味)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(脂香味)、(E)-2-辛烯醛(油脂味)、(E)-2-壬烯醛(肉香味)、2-戊基呋喃(青草香味)是牡蠣獨有的主要揮發性物質,與已有相關文獻[24-26]報道一致。將OAV進行熱圖可視化處理(圖3),凈化前、凈化后組聚集,說明其揮發性物質含量相似度較高;保活6 d和保活3、9 d分別在2 個不同大類分支上,表明牡蠣在流通階段揮發性風味物質含量具有差異。暫養凈化后醛酮類化合物OAV較凈化前明顯下降,提示牡蠣脂肪氧化得到明顯緩解,愉悅性風味成分得到改善;誘導休眠至保活流通階段,牡蠣體內揮發性風味化合物較凈化前明顯上升,醛酮類化合物隨著保活時間的延長明顯積聚,提示脂質氧化進一步加劇,其中戊醛、己醛、E-2-庚醛等醛類化合物是油酸和亞油酸的氧化降解產物[25],賦予牡蠣清香、脂肪香、花香、新鮮氣味。Zhang Zuoming等[27]研究發現,腐敗變質的牡蠣組織中三甲胺、二甲硫化合物占主導地位,而本研究在各流通階段均檢出以上物質,可見牡蠣仍保留較高的鮮香氣味。

表2 太平洋牡蠣不同流通階段揮發性風味物質OAVTable 2 OAVs of volatile flavor substances in C.gigas during different circulation stages

圖3 太平洋牡蠣不同流通階段揮發性風味物質OAV變化熱圖Fig.3 Heatmap of changes in OAVs of volatile flavor substances in C.gigas during different circulation stages
為了更直觀體現活體太平洋牡蠣不同流通階段氣味特征差異,依據OAV篩選結果,選取關鍵香氣成分進行PCA。如圖4所示,箭頭代表各揮發性風味物質組成分二維和三維空間的投影,箭尖距離原點越遠,表示該變量被主成分解釋的程度越高[28]。由圖4a可知,不同流通階段牡蠣樣品整體區分度較高,凈化前組牡蠣處于第2象限,對PC2有正響應值;凈化后組與誘導休眠組牡蠣處于第3象限,對PC1、PC2均具有負響應值;保活第3天處于第4象限,對PC1有正響應值;保活第6、9天處于第1象限,對PC1、PC2均具有正響應值,可見,牡蠣在不同流通階段有明顯的區分度。由圖4b可知,PC1、PC2、PC3表示太平洋牡蠣樣品的三維分析圖,PC的貢獻率分別為59.4%(PC1)、15.8%(PC2)和10.4%(PC3),累計貢獻率為85.6%,同樣表明PC1、PC2和PC3能夠較好地反映太平洋牡蠣中大部分揮發性風味化合物的信息,同時也進一步說明了活體牡蠣體內揮發性風味化合物在長時保活流通過程中隨著時間的延長而發生了明顯的變化。

圖4 太平洋牡蠣不同流通階段揮發性風味物質PCA二維圖(a)、三維圖(b)Fig.4 Two-(a) and three-(b) dimensional PCA plots of volatile flavor substances in C.gigas at different circulation stages
采用GC-MS技術分析活體太平洋牡蠣不同流通階段揮發性風味物質組成與含量變化情況,共鑒定出49 種揮發性風味化合物,確定醛、酮、酯類化合物為活體牡蠣主要風味物質,其含量變化可作為反映生理狀態的參考;牡蠣采捕離水后,應激脅迫對其揮發性風味物質影響較大;通過24 h暫養凈化,牡蠣愉悅性風味化合物明顯提升,刺激性氣味化合物明顯降低,脂質氧化得到明顯的緩解;誘導休眠至保活流通階段,牡蠣脂質氧化隨著保活流通時間的延長加劇,揮發性風味物質呈緩慢下降趨勢。太平洋牡蠣采捕后通過暫養凈化24 h,機體活力品質與風味物質達到新的水平,更有利于后期長時低溫無水保活;同時揮發性成分分析可以作為活體貝類流通過程中活力品質鑒定的一種方法。