乳清酒發酵過程中細菌群落演替與風味物質變化的相關性分析

王 慧，吳小燕，夏亞男，王玉榮，洋 洋，烏有娜，雙 全

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010000）

乳清作為制造干酪和干酪素的加工副產物，營養價值豐富，如果將其排放，不僅會造成資源浪費，同時也會造成環境污染。目前，一些乳業發達國家如荷蘭、德國、美國已經擁有了較強的乳清加工能力，與這些國家相比，我國對于乳清廢液的處理能力相對落后[1]。因此，乳清資源的合理開發和利用已經成為了急需解決的問題。

近年來，研究人員一直致力于將乳清更加合理利用，實現乳清的商業價值。毛婷等[2]研制一款發酵型牦牛乳清酒，口感獨特，得到了大量開發應用。孫子羽等[3]對黑枸杞乳清酒中揮發性風味物質進行研究分析，檢測到的揮發性風味物質中，以酯類物質為主，主要成分是癸酸乙酯和辛酸乙酯，其次是醇類、酸類、醛類、烴類物質。張敏[4]研制一款低醇乳清酒，篩選出最佳發酵菌種并對乳清酒的氨基酸含量進行分析得出含量由高到低依次是谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸等。乳清酒發酵過程中微生物在其生產和風味形成過程中發揮了至關重要的作用。但截至目前，缺少對乳清酒微生物多樣性和風味的相關研究，無法為乳清酒的生產及工藝優化提供指導。

本研究擬采用氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀對乳清酒發酵過程中的揮發性風味物質變化進行分析，運用高通量測序技術對乳清酒發酵過程中的細菌菌落結構進行解析，并進一步展開相關性分析，揭示乳清酒發酵過程中微生物群落結構演替對風味物質形成的推動作用，以期為乳清發酵酒的風味調控及乳清產業鏈的發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗、桑葚、枸杞、葡萄干、白砂糖、乳清粉均為市售。

酵母菌為ALE -514 澳洲馬利釀酒干酵母（Saccharomyces cerevisiae），商品名Maurivin。

乳酸菌為PC-01 食用乳酸菌，配料：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lacotbacillus bulgaricus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

1.2 儀器與設備

TAISITE高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；bluepard生化培養箱 天津泰斯特儀器有限公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清酒釀造工藝

原料→清洗→粉碎→滅菌→調糖→調pH值→發酵→過濾→裝瓶

操作要點：1）原料：挑選大小均勻、成熟且無蟲害潰爛；枸杞、桑葚、紅棗、葡萄干和乳清液的添加量為20.0、20.0、15.0、10.0 g/L和10%。2）清洗：將原料用去離子水清洗2 次，除去原料表面灰層等雜質。3）粉碎：使用高速萬能粉碎機將原料進行粉碎。4）滅菌：將灌裝好的乳清發酵酒進行水浴滅菌，溫度99 ℃，時間30 min。5）調糖度：使用白砂糖將可溶性固形物調整到6.0%左右。6）調pH值：使用檸檬酸、檸檬酸鈉將pH值調整到5.2。7）發酵：分別加入酵母菌和乳酸菌200.0 mg/L和60.0 mg/L，發酵溫度22 ℃，發酵時間28 d，發酵前1 周進行適合搖晃，1 周后保持無氧發酵。8）過濾：發酵后的乳清酒含有殘渣、沉淀物；使用5 層紗布過濾，將發酵殘渣、沉淀物分離除去。9）取樣：取發酵第0、7、14、21、28天的樣品保存，以備后續實驗。

1.3.2 揮發性風味物質的測定

1.3.2.1 樣品準備

取5 mL樣品加入20 mL頂空瓶中，加蓋密封。

1.3.2.2 固相微萃取條件

萃取纖維：50/30 μm DVB；萃取溫度50 ℃；振蕩15 min、萃取30 min；振蕩速率250 r/min；解吸時間5 min；GC循環時間50 min。

1.3.2.3 GC-MS條件

色譜柱：DB-wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣溫度260 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；流量1 mL/min；柱溫：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min；接口溫度260 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為電子電離源，70 eV；掃描方式為全掃描；質量范圍20～400 u。

1.3.2.4 氣味活性值（odor activity value，OAV）計算

OAV為組分在樣品中含量與該組分氣味閾值之比。

1.3.3 細菌多樣性解析

1.3.3.1 樣品總DNA提取

參照E.Z.N.A.?Soil DNA kit試劑盒中的方法對乳清酒樣品中宏基因組的總DNA進行檢測。

1.3.3.2 PCR擴增及MiSeq高通量測序

細菌16S rRNA基因V3～V4可變區：上游引物：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。擴增程序：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。使用引物338F和806R對細菌V3～V4區域進行擴增，對純化后的擴增產物進行高通量測序，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 數據統計與分析

基因功能預測：使用PICRUSt軟件對乳清酒樣品中微生物的基因功能進行預測[5]。直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）功能注釋：參照蛋白質COG數據庫進行[6]。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋：運用FMAP軟件進行KEGG注釋和差異Module分析。采用IBM SPSS Statistics 26和R軟件進行統計學分析，使用Origin 2021和美吉云平臺進行作圖。風味物質與微生物相關性分析通過計算Spearman相關系數繪制相關性網絡圖。

2 結果與分析

2.1 乳清酒香氣成分分析

2.1.1 乳清酒發酵過程中揮發性風味物質的變化

由圖1可以看出，在不同發酵時間，乳清酒物質種類較豐富；同時離子相對強度也不同，說明在發酵期間乳清酒各揮發性物質的含量不同。由圖2可知，在發酵過程中共檢測到酯類、醛酮類、烷烴類、醇類、其他類5大類物質。其中酯類物質在發酵過程中種類最多，發酵開始時共檢測到41 種風味物質，到達發酵終點時檢測到55 種風味物質，說明乳清酒發酵過程中風味物質的數量整體增加，酒體變得豐富，香氣逐漸濃郁。

圖1 乳清酒發酵期間總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of whey wine with different fermentation periods

圖2 乳清酒發酵期間各類揮發性風味物質數量變化Fig.2 Variation in the types of volatile flavor substances in whey wine during fermentation

2.1.2 乳清酒香氣化合物的定量分析

乳清酒的主要香氣來源于原料本身和微生物發酵[7]。這些揮發性化合物通過富集作用使乳清酒香氣濃郁[7]。乳清酒發酵期間共檢測出102 種揮發性風味物質，其中酯類物質38 種，醛酮類物質24 種，醇類物質10 種，烷烴類物質10 種，酸類物質7 種，其他類物質13 種。圖3為含量前30的風味物質的變化圖。在發酵期間，各類物質含量變化較明顯。總體呈先增加后減少的趨勢，這與裴鵬正等[7]研究的軟兒梨果酒結果一致。

圖3 乳清酒發酵期間揮發性風味物質含量的變化Fig.3 Changes in contents of volatile flavor substances in whey wine during fermentation

酯類物質是乳清酒的主要香氣物質，酯類的形成受醪液理化組成及發酵條件的影響，乙醇發酵階段，在酯酶催化作用下酰基CoA與乙醇合成脂肪酸乙酯，乙酰CoA和高級醇合成乙酸酯[8]。發酵酒酯類物質的種類隨發酵的進行明顯增多，發酵結束時檢測出26 種酯類物質。多數酯類在發酵過程中呈先增加后降低的趨勢，是由于發酵前期發酵液中醇類物質與酸類物質發生酯化反應，使得乳清酒中酯類物質增加；發酵后期含量降低可能是微生物將其分解或轉化為其他物質[9]。大多數酯類具有怡人的花香味，如苯甲酸乙酯帶有濃郁的花香味，癸酸乙酯帶有葡萄似水果香味[10]。其中乙酸異戊酯、乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯在發酵過程中一直存在，主要賦予發酵酒果香味。

醛酮類物質能與醇類物質相互反應，產生怡人、和諧的香氣。乳清酒發酵過程中共檢測出14 種醛類物質，10 種酮類物質。其中包括構成發酵酒原料之一紅棗的主要香氣成分己醛[11]，主要呈青草氣及蘋果香氣。同時乙醛的形成可能是發酵液中木質素降解產生[12]，賦予酒體果香和干果味。

醇類化合物是組成乳清酒香氣成分的重要物質，少量高級醇可使酒體的香氣更加飽滿。發酵過程中苯乙醇含量（2369.61 mg/kg）最多，具有清香的玫瑰花香。異戊醇是高級醇的主要成分，主要呈辛辣味[13]，隨著發酵的進行，乳清酒中異戊醇逐漸消失，說明酒體柔和，更易被大眾接受。

酸類物質是風味形成的主要物質，同時也是酯類物質的前體物質，具有平衡口感的作用。乳清酒發酵過程中乙酸、辛酸和癸酸呈增加趨勢，乙酸是發酵制品中重要的風味物質，使得酒體口感酸而不澀。有報道稱辛酸和癸酸對奶香味貢獻較大[14]，是乳清酒的獨特風味物質。同時辛酸還能促進胃排空，緩解消化不良[15]。其他酸類物質在發酵后期減少可能與酯化反應有關。2,4-二叔丁基酚、4-乙基苯酚和苯乙烯是發酵酒的主要芳香化合物，主要呈水果香和花香，香味突出，這是酒體優雅、醇厚等風味形成的關鍵[16]。

2.1.3 乳清酒風味物質的OAV分析

對揮發性化合物定性定量分析后，根據的氣味閾值[17]計算各類物質的OAV。通常認為OAV≥1的化合物為香氣貢獻成分，OAV≥10的化合物為重要香氣成分。上述103 種揮發性化合物中有43 種化合物OAV大于1，見表1。在發酵第7天時，香氣物質開始顯著增加，其中OAV≥10的有苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乙酸乙酯、十一酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯丙酸乙酯、癸酸異戊酯、壬醛、2-十一酮、辛酸、苯乙醇、4-乙基苯酚構成了乳清發酵酒的重要香氣成分。這與任曉宇等[18]在紅棗白蘭地香氣分析中的結果相似，苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、苯丙酸乙酯等乙酯類化合物具有較高的OAV，它們共同賦予酒體水果香味。發酵后期增加了癸酸乙酯、己酸乙酯、2-壬酮為主要香氣成分，分別賦予乳清酒青蘋果和草莓的果香味。

表1 乳清酒發酵過程中揮發性風味物質OAV變化Table 1 Changes in OAV of volatile flavor substances in whey wine during fermentation

2.2 乳清酒細菌群落結構分析

2.2.1 乳清酒細菌α多樣性分析

通過細菌16S rRNA序列測序從15 個樣本中共獲得226550 條有效序列，所有樣本細菌序列歸屬于24 個門，52 個綱，105 個目，151 個科，212 個屬，262 個種，293 個可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。樣本覆蓋率均大于0.90，表明所選樣本有效序列的測序深度較高，可以反映整個微生物群落的真實情況（表2）。對于群落的物種多樣性來說，乳清酒的Shannon指數從第7天時開始降低，到28 d增加，這可能是因為在發酵過程乙醇含量開始增加，具有低氧、低pH值以及高乙醇的不利條件，使得許多不耐乙醇和酸的微生物隨之消亡[19]，導致多樣性降低。發酵酒發酵前7 d的細菌Chao1指數較小，隨后大幅度上升，這表明乳清酒在發酵初期微生物群落豐富度最低，經過發酵作用后菌群豐富度上升。

表2 乳清酒酒樣細菌α多樣性指數測定結果Table 2 α-Diversity indexes of bacteria in whey wine

由圖4可知，乳清酒發酵過程共有的OTU為21 個。在發酵前，樣品中特有的OTU數為7 個，發酵7 d，OTU數快速下降，發酵后期樣品在環境中獲得了大量的菌體，發酵21 d，特有OTU數快速增加為68 個。發酵結束時，特有OTU增加為87 個。再將每個OTU與細菌分類學數據庫進行比對，得到每個OTU的物種注釋，共注釋得到3 個門、12 個屬的細菌。

圖4 乳清酒酒樣細菌OTU的統計和比較Fig.4 Venn diagram of unique and shared bacterial OTUs in whey wine with different fermentation periods

2.2.2 基于門水平乳清酒發酵過程中群落結構分析

由圖5所示，在門水平，乳清酒細菌群落由厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）和其他（others）構成。發酵開始存在Proteobacteria與Cyanobacteria，可能來源于發酵酒的原料和環境。Firmicutes和Proteobacteria在整個發酵過程中占絕對優勢地位，但二者呈相反的變化趨勢。隨著發酵的進行，Firmicutes相對豐度雖然有所浮動，但在整個發酵期間的含量仍為最高。Proteobacteria在發酵開始時達到峰值22.41%，在發酵終點時的平均相對含量為2.43%。這可能因為Proteobacteria的部分好氧菌在低氧、酸性和高醇的環境中難以生存[20]。而Firmicutes的乳酸菌可以適應這種環境，這也說明Firmicutes在乳清酒發酵中發揮了重要作用，與Sun Zhihong等[21]報道結果一致。

圖5 基于門水平的乳清酒酒樣的細菌群落結構Fig.5 Bacterial community structure in whey wine samples at the phylum level

2.2.3 基于屬水平乳清酒發酵過程中群落結構分析

由圖6可知，在屬水平上，乳清酒發酵過程中共檢測到的相對豐度大于1%的細菌屬有7 個，分別是乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、拉烏爾菌屬（Raoultella）。發酵前期Lactobacillus為絕對優勢菌群，隨著發酵的進行Lactobacillus和Lactococcus成為絕對優勢菌群。在發酵過程中，乳酸菌是存在于乳清酒發酵中的優勢菌種，乳酸菌能將乳制品中可發酵糖類轉化為乳酸、水解酪蛋白、分解脂肪，進行檸檬酸發酵。乳酸菌產生的酶和代謝產物在發酵酒的酸度、口感、香氣和質地中發揮著重要作用。研究學者認為可以通過對乳酸菌的基因調控如丙酮酸脫羧酶、NADH氧化酶和α-乙酰乳酸脫羧酶等控制乳中風味代謝物的產生[22]。同時，乳酸菌也是酸肉、香腸發酵中的優勢細菌[23]。

圖6 基于屬水平的乳清酒酒樣的細菌群落結構Fig.6 Bacterial community structure in whey wine samples at the genus level

2.2.4 乳清酒細菌β多樣性分析

在16S rRNA基因序列分析中，基于Unifrac距離主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）被廣泛使用，在圖中的距離越近，說明樣品間組成相似度越高。

PC1和PC2分別解釋了不同發酵時間乳清酒中細菌群落57.27%和28.57%的信息，累計解釋了85.84%的信息。由圖7可知，發酵0 h，樣本主要集中在第3象限。發酵過程中的樣本呈較明顯的聚類。發酵7～14 h的樣本距離較近，聚集于第2象限。發酵21～28 h樣本主要集中在第4象限。

圖7 基于加權Unifrac距離的樣本細菌群落PCoA圖Fig.7 PCoA plot of bacterial communities based on weighted Unifrac distance

由圖8可知，乳清酒發酵期間樣本可聚為3 類，發酵0 d聚集為第1大類，發酵7～14 d聚集為第2大類，發酵21～28 d聚集為第3大類。結合PCoA可得到一致的結論，即乳清酒發酵可分為：0 d（發酵初期）、7～14 d（發酵中期）、21～28 d（發酵后期）。

圖8 基于OTU水平樣板細菌群落層級聚類分析圖Fig.8 Hierarchical cluster analysis of bacterial community based on OTUs

2.2.5 細菌功能預測

2.2.5.1 COG數據庫注釋分析

由圖9可知，通過對乳清酒細菌菌群COG功能預測，發現在乳清酒細菌菌群中共鑒定到20 個主要的功能大類，乳清酒中的微生物一部分豐度較高的基因參與到未知功能和已知功能這兩個COG分類中，其中相對含量在前8 位的功能大類為：碳水化合物轉運與代謝，均值為1309157 個；常規功能預測，均值為1251161 個；氨基酸轉運與代謝，均值為1203998 個；轉錄，均值為1120427 個；復制、重組與修復，均值為1071133個；翻譯、核糖體結構及合成，均值為1023398 個；細胞壁/膜/被膜的生物合成，均值為825269 個；無機離子的轉運與代謝，均值為741526 個，除微生物基本生命活動外，代謝活動主要以氨基酸代謝和碳水化合物代謝為主。本研究與夏亞男[24]、Chen Chen[25]等采用宏基因組分析酒藥中微生物多樣性的結果一致，在酒藥所有活性代謝途徑中，碳水化合物代謝和氨基酸代謝最為活躍，而碳水化合物代謝和氨基酸代謝這兩類代謝通路與風味物質形成密切相關。

圖9 細菌基因COG功能分類Fig.9 COG functional classification of bacterial genes

2.2.5.2 KEGG 數據庫注釋分析

通過與KEGG數據庫進行對比可知（表3），共注釋到6 類一級代謝通路，在二級代謝通路中共注釋到42 個子功能組成，表3為代謝通路豐度值前22 位的結果。

表3 乳清酒酒樣細菌α多樣性指數測定結果Table 3 α-Diversity indexes of bacteria in whey wine

富集差異表達基因最多的8 個KEGG通路包括膜運輸（2171276）、碳水化合物代謝（1856934）、氨基酸代謝（1444883）、復制和修復（1367350）、翻譯（924207）、特征差（862876）、能量代謝（742465）、核苷酸代謝（742042）。其中，碳水化合物代謝及氨基酸代謝是最主要的兩類代謝活動，與COG功能注釋結果一致。具體地，碳水化合物代謝主要包括三羧酸循環、糖酵解和磷酸戊糖途徑等，可產生大量的乙酸、檸檬酸等風味中間代謝產物[26]。氨基酸可以在酶的作用下產生風味成分[27]，由此推測，乳清酒的主要風味物質來源于碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑。

2.3 細菌與風味物質相關性分析

由圖10可知，大多數的風味物質與Lactococcus和Raoultella呈正相關，其中Lactococcus和Raoultella與乙酸苯乙酯（A4）、癸酸乙酯（A8）、己酸乙酯（A17）、乙酸乙酯（A20）呈顯著正相關，說明Lactococcus和Raoultella與這些物質的合成有關。Lactobacillus與檸檬醛（B11）、辛酸（E5）、癸酸（E7）、4-乙基苯酚（F8）、庚酸乙酯（A6）、癸酸甲酯（A9）、油酸乙酯（A11）、水楊酸甲酯（A13）、壬酸乙酯（A16）、十一酸乙酯（A22）、辛酸異戊酯（A25）和癸酸異戊酯（A29）呈正相關。Meng Yuecheng等[28]研究牛乳發酵過程中揮發性風味物質與核心微生物關聯分析時發現，乳酸桿菌與酸類、酯類物質之間呈正相關。

圖10 乳清酒細菌與風味物質的相關性Fig.10 Correlation between bacteria and flavor substances in whey wine

Streptococcus與酯類等風味化合物呈負相關可能與糖苷酶水解風味物質引起的變化有關[29]。Acinetobacter在酸馬奶的發酵中也與大多數物質呈負相關[10]，與物質之間的分解作用有關。Leuconostoc可進行乳酸菌異型發酵產酸，營造酸性環境[30]，與酸類和酯類物質呈負相關。Klebsiella可產生脂肪酶，賦予發酵酒飽和柔軟的香氣[31]。

3 結論

通過采用高通量測序技術和PICRUSt軟件分析乳清酒的細菌多樣性及對細菌類群的基因功能進行了預測，采用GC-MS分析了乳清發酵酒中重要香氣成分的變化規律，并對二者進行相關性分析。研究表明乳清酒發酵過程中風味物質的數量整體增加，共檢測出102 種揮發性風味物質，其中苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乙酸乙酯、十一酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯丙酸乙酯、癸酸異戊酯、壬醛、2-十一酮、辛酸、苯乙醇、4-乙基苯酚構成了乳清酒的重要香氣成分。乳清酒發酵初期Lactobacillus為絕對優勢菌群，隨著發酵的進行Lactobacillus和Lactococcus成為絕對優勢菌群。細菌功能預測表明，乳清酒代謝活動主要以氨基酸代謝和碳水化合物代謝為主。通過對二者的關聯性分析得出：大多數風味物質與Lactococcus和Raoultella呈正相關，其中Lactococcus和Raoultella與乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯呈顯著正相關。Lactobacillus與檸檬醛、辛酸、癸酸、4-乙基苯酚、庚酸乙酯、癸酸甲酯、油酸乙酯等呈正相關。因此，構建良好的細菌群落有利于提升釀造乳清酒的品質。