4 種多糖益生元對鼠李糖乳桿菌微膠囊穩定性的影響

劉炯娜，徐玉巧，范方宇

（西南林業大學生命科學學院，西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）具有調節腸道益生菌菌群、增強人體免疫力的功能[1]。當益生菌活菌數高于6（lg（CFU/g））時，可在腸道內定植，并發揮預期的健康作用[2]。貯藏和食用期間，益生菌易受水分、溫度、胃酸、膽鹽等影響，導致其活性降低，甚至失活[3]。為穩定LGG的活性，采用微膠囊技術提升LGG穩定性是一種有效方法。如王遠一飛等[4]采用殼聚糖/黃原膠制備了LGG微膠囊，結果表明微膠囊化對LGG有較強的保護作用。采用復合凝聚法、噴霧干燥制備的LGG微膠囊，可有效降低外界環境對LGG的影響[5]，但噴霧干燥過程中的高溫損傷、滲透壓變化等，易導致益生菌存活率降低，因此如何有效提高益生菌微膠囊穩定性是研究者探索的熱點之一。

益生元是一種寡糖型短鏈碳水化合物，不被人體消化吸收，但可被腸道中的微生物（如雙歧桿菌）利用，促進腸道益生菌增殖，進一步促進調節脂質代謝和增強鈣的吸收能力[6-7]。有研究者發現，益生元為益生菌提供營養，促進益生菌增殖，并抑制腸道致病菌生長和定植，對腸道中的益生菌具有一定的保護作用[8-9]。如李雅麗等[10]研究發現不同益生元對益生菌的作用效果差異顯著，乳糖對乳雙歧桿菌BL-99的增殖效果較好，而低聚半乳糖對嬰兒雙歧桿菌YLGB-1496、副干酪乳桿菌K56、副干酪乳桿菌ET-22的增殖效果較好。Anzawa等[11]將乳雙歧桿菌GCL2505和菊粉制成合生元飲料，可有效提高人體內雙歧桿菌的增殖。Duque等[12]研究表明，益生菌中添加益生元可提高益生菌的存活率。Nunes等[13]噴霧干燥嗜酸乳桿菌La-5發現，加入菊糖、海藻糖和高直鏈淀粉對嗜酸乳桿菌La-5具有較好的保護作用。由于每種益生菌的代謝途徑和產生的酶不同，不同益生菌對益生元的利用也有一定區別[14]。目前，研究不同益生元對LGG微膠囊穩定性的影響還鮮有報道。

基于此，本研究添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖4 種益生元制備LGG微膠囊，研究LGG微膠囊模擬胃腸消化實驗，分析LGG微膠囊的耐膽鹽、耐熱性、貯藏性、熱穩定性，并采用掃描電鏡和差示掃描量熱儀對LGG微膠囊進行表征，旨在為后續益生元在LGG微膠囊的進一步利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LGG（ATCC 53013）凍干粉 美國菌種保藏中心。益生元具體參數如表1所示。

表1 4 種益生元Table 1 Information on four prebiotics

B型明膠（gelatin，GE）、阿拉伯膠（gum arabic，GA）國藥集團化學試劑有限公司；谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG酶，100 U/g） 泰興市東勝食品科技有限公司；豬膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶（3000 U/mg） 中國Biosharp公司；胰蛋白酶（250 U/mg） 德國Biofroxx公司。

1.2 儀器與設備

B-290小型噴霧干燥儀 瑞士Büchi實驗室儀器公司；PHS-25 pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；THZ-82氣浴恒溫搖床 上海力辰儀器科技有限公司；3K15離心機 德國Sigma公司；S-3000N掃描電鏡日本Hitachi公司；差示掃描量熱儀 德國Netzsch儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 益生元LGG微膠囊的制備

基于本課題組方法[5]，以復合凝聚法制備益生元LGG微膠囊。配制質量分數為1.5%的GE和GA混合溶液200 mL，GE和GA質量比為1∶1，加入0.5%益生元，40 ℃水浴攪拌溶解，加入9（lg（CFU/g））濃縮菌液，混勻后用0.5 mol/L的HCl溶液調pH 3.75，40 ℃恒溫水浴攪拌60 min，轉速200 r/min。將反應體系自然冷卻至室溫，用0.5 mol/L的NaOH溶液調pH 6.0，加入TG酶（添加量為25 U/g，以GE質量計）進行交聯反應，冰浴中繼續攪拌3 h。2000 r/min離心5 min收集微膠囊，用無菌水洗滌2 次，清除表面的菌體。將濕囊與無菌水配備成懸浮液進行噴霧干燥。噴霧干燥參數：進風溫度170 ℃，進料流量9 mL/min，進料量30%，出風溫度約80 ℃。

1.3.2 性質測定

1.3.2.1 模擬胃腸消化特性

模擬胃液[17]：將質量分數3%的胃蛋白酶（3000 U/mg）、2%的NaCl添加至無菌水中，用0.5 mol/L的HCl溶液調pH 2.0，過0.22 μm濾膜除菌備用。

模擬腸液[18]：將質量分數0.1%的胰蛋白酶（250 U/mg）添加至pH 6.8的無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，過0.22 μm濾膜除菌備用。

基于姚澤晨等[19]的方法進行修改，測定模擬胃腸道實驗中未添加益生元LGG微膠囊（空白組）和添加益生元LGG微膠囊（益生元組）的活菌數。待測樣品溶于模擬胃液中，37 ℃、100 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養，分別在0、30 min和60 min取樣進行活菌計數。

在模擬胃液中培養60 min后，10000 r/min離心5 min，棄上清液，將沉淀物添加至模擬腸液中（總體積10 mL），在60、120 min取樣進行活菌計數。

1.3.2.2 膽鹽耐受性

將空白組和益生元組LGG微膠囊分別添加至0.1%、0.3%和0.6%的膽鹽溶液中，3 h后離心，取沉淀于無菌PBS中進行活菌計數。

1.3.2.3 耐熱性

將0.02 g空白組和益生元組LGG微膠囊分別置于2 mL無菌離心管中，加入1 mL無菌PBS，離心管分別在55、65 ℃和75 ℃水浴，10 min和30 min時迅速取出離心管，冰水浴冷卻，冷卻后轉移至37 ℃培養箱，待微膠囊溶解后涂布計數。

1.3.2.4 貯藏穩定性

不同水分活度的貯藏性：根據課題組研究方法[5]，將空白組和益生元組微膠囊分別置于水分活度為0.11、0.33、0.75環境中保存8 周，每周測定一次活菌數。

常溫條件下的貯藏性：將微膠囊置于常溫條件下保存8 周，每隔1 周計算活菌數。測定活菌數時，每次取0.1 g微膠囊置于10 mL無菌PBS中，37 ℃恒溫振蕩至完全溶解，用稀釋梯度法涂布平板計數。

1.3.2.5 差示掃描量熱分析

在N2氛圍下進行測試，分別取空白組和益生元組微膠囊5～10 mg，升溫速率10 ℃/min，測試溫度范圍25～250 ℃[5]。

1.3.3 表觀形態觀察

分別取少量空白組和益生元組微膠囊置于導電膠表面后噴金90 s，通過掃描電鏡觀察樣品表觀形態，放大倍數3000，加速電壓15 kV。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 微膠囊性能分析

2.1.1 LGG微膠囊模擬胃腸道消化實驗

益生菌發揮作用的最終部位為腸道，LGG經口進入人體后，需要抵御胃酸中的高濃度氫離子的影響，才可到達腸道發揮益生菌的作用[19]。由表2可見，無論是否添加益生元，微膠囊經過模擬胃腸消化后，其活菌數仍然可以保持較高，說明微膠囊化對LGG具有保護作用。添加益生元的LGG微膠囊初始活菌數均高于空白組，其中菊糖和水蘇糖顯著提高LGG存活率（P＜0.05）。原因為多糖類物質在噴霧干燥過程中可以取代從細胞內蛋白質中損失的水分，提高細胞膜的耐受溫度，改善益生菌在干燥過程中的存活率[20]。益生元屬糖類物質，干燥的LGG細胞組分與益生元直接相互作用，減小高溫對LGG損傷，在干燥過程中保持細胞的活性，提高微膠囊中LGG的存活率。模擬胃腸道實驗前后，空白組活菌數下降了約0.3（lg（CFU/g）），添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖分別下降了約0.9、0.6、0.7（lg（CFU/g））和1.6（lg（CFU/g））。可見，添加益生元的微膠囊在模擬胃腸道實驗時并未提供額外的保護作用。經模擬腸液處理120 min，未加益生元組活菌數為7.5（lg（CFU/g）），添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的LGG微膠囊活菌數分別達到了約9.5、9.0、9.0（lg（CFU/g））和8.5（lg（CFU/g））。模擬胃腸道處理后添加益生元的4 組微膠囊的活菌數均大于空白組（P＜0.05），結果表明添加益生元的微膠囊在到達腸道時LGG能發揮更好的作用。在常依柳等[21]添加益生元的長雙歧桿菌微膠囊、鄧紫玙等[22]添加羧甲基茯苓多糖的植物乳桿菌微膠囊研究中也發現了類似的結果。

表2 LGG微膠囊在模擬胃腸道中的活菌數Table 2 Viable count of LGG microcapsules under simulated gastrointestinal conditions（lg（CFU/g））

2.1.2 LGG微膠囊耐膽鹽分析

膽鹽是參與脂肪消化和吸收的鈉鉀鹽，會破壞益生菌的細胞膜結構，使其發生氧化損傷失活。由圖1可知，隨膽鹽添加量增加，空白組和益生元組的活菌數均降低，表明膽鹽溶液對LGG有一定損害作用，但益生元組的活菌數始終比空白組高，其中添加水蘇糖的LGG微膠囊對膽鹽更具有耐受性。3 種膽鹽添加量下，添加水蘇糖的LGG微膠囊都具有最高的存活數。經0.1%膽鹽溶液處理后，空白組LGG活菌數下降了2.6（lg（CFU/g）），添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的活菌數分別下降了1.4、1.1、1.3（lg（CFU/g））和1.6（lg（CFU/g））。當膽鹽添加量為0.6%時，空白組下降4.7（lg（CFU/g）），添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的LGG微膠囊活菌數分別下降3.9、4.0、4.1（lg（CFU/g））和2.6（lg（CFU/g））。由此可見，在低膽鹽環境下，添加益生元顯著增強了微膠囊對LGG 的保護作用（P＜0.05），且添加水蘇糖的保護效果最佳。原因為干燥介質中的益生元，可在細胞內積聚并減小內部和外部環境之間的滲透壓，有效降低膽鹽對益生菌的損傷[23]。

圖1 不同膽鹽添加量時LGG微膠囊活菌數Fig.1 Viable count of LGG microcapsules with different bile salt concentrations

2.1.3 LGG微膠囊耐熱性分析

由表3可見，隨著溫度的升高和時間的延長，LGG微膠囊活菌數逐漸減少，但添加益生元的LGG微膠囊活菌數均高于空白（P＜0.05）。55 ℃、10 min后，空白組的活菌數下降了約3.1（lg（CFU/g）），添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的LGG微膠囊活菌數分別下降約1.9、1.8、0.9（lg（CFU/g））和0.4（lg（CFU/g））；75 ℃、30 min后，空白組下降約4.2（lg（CFU/g）），4 種添加益生元的LGG微膠囊活菌數分別下降約3.4、3.7、3.5（lg（CFU/g））和2.3（lg（CFU/g））。結果表明，添加益生元提高了LGG微膠囊的耐熱性，且不同益生元對LGG微膠囊的影響不同（耐熱性：水蘇糖＞菊糖＞普魯蘭多糖＞低聚果糖），在75 ℃、30 min后添加水蘇糖的LGG微膠囊活菌數仍達8.7（lg（CFU/g））。相關研究中，Bilenler等[24]研究發現，在70 ℃熱處理后，添加淀粉的植物乳桿菌和木糖葡萄球菌微膠囊在70 ℃條件下，仍可保持較高活性，可提高益生菌微膠囊對高溫的耐受能力。Li Haiping等[25]研究表明，在高溫條件下，添加木瓜多糖的干酪乳桿菌ATCC 334的存活率和熱穩定性比未添加木瓜多糖的益生菌高，在逆境下木瓜多糖對干酪乳桿菌ATCC 334具有保護作用。這可能是添加的益生元穩定性好、耐高溫可減緩熱量向微膠囊內部擴散[26]，從而增強了益生菌微膠囊的耐熱性。

表3 不同溫度條件 LGG微膠囊活菌數Table 3 Viable count of LGG microcapsules at different temperatures（lg（CFU/g））

2.1.4 LGG微膠囊不同水分活度下的貯藏穩定性

圖2a中，水分活度0.11條件下，空白組和添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖、水蘇糖4 種益生元的LGG微膠囊活菌數在8 周內分別下降了3.0、3.2、3.6、5.6、6.7（lg（CFU/g）），結果表明益生元不能有效提高微膠囊的貯藏穩定性，添加水蘇糖的LGG微膠囊在8 周后的活菌數還低于空白組。圖2b中，水分活度0.33條件下，各組LGG微膠囊隨時間延長，活菌數快速下降。空白組的微膠囊活菌數第5周開始低于2.0（lg（CFU/g））；菊糖組從第7周開始低于2.0（lg（CFU/g））。其他3 組添加益生元微膠囊在第8周保持了一定水平的活菌數，其中低聚果糖組貯藏穩定性最佳。圖2c中，5 組微膠囊在水分活度0.75條件下，活菌數下降迅速。原因為水分活度增加，加快了益生菌脂質發生氧化，導致菌體失活[27]。第2 周開始普魯蘭多糖組檢測不到活性（活菌數＜2.0（lg（CFU/g））），空白組在第3周失去活性，其他3 組微膠囊活菌數隨時間陸續失去活性。其中低聚果糖在高水分活度條件下對LGG微膠囊提供了較好的保護效果，在第6周時仍保持了3.3（lg（CFU/g））的活菌數。原因為低聚果糖在一定的溫度條件下可取代水分子，并與益生菌體內的蛋白質極性基團或磷脂基團形成氫鍵，從而保護益生菌中蛋白質和細胞膜結構和功能的完整性。此外，低聚果糖屬大分子多糖類，雖不能透過益生菌的細胞壁和細胞膜，但可降低溶質濃度，保護益生菌[28]，且高水分活度下，低聚果糖作為唯一碳源，其對LGG的促生長效果可能更好[29]。

圖2 LGG微膠囊在不同水分活度下的活菌數Fig.2 Viable count of LGG microcapsules under different water activities

2.1.5 LGG微膠囊常溫條件下的貯藏穩定性

由表4可見，4 種益生元LGG微膠囊的活菌數在常溫貯藏的第1周開始顯著下降（P＜0.05）；未加益生元的LGG微膠囊活菌數第2周開始顯著下降。隨著貯藏時間延長，未加益生元、添加低聚果糖和水蘇糖的LGG微膠囊活菌數顯著下降（P＜0.05）；在第8周后，空白組LGG微膠囊活菌數下降了1.9（lg（CFU/g）），添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖、水蘇糖4 種益生元的LGG微膠囊活菌數分別下降了0.8、1.5、2.1（lg（CFU/g））和2.5（lg（CFU/g））。各組噴霧干燥微膠囊在第8周時均保持較高的活性（活菌數＞6（lg（CFU/g））），5 組微膠囊的貯藏穩定性為：菊糖組＞水蘇糖組＞低聚果糖組＞普魯蘭多糖組＞空白組（P＜0.05）。總之，常溫貯藏時，LGG微膠囊可以保持較好的穩定性，益生元的添加為LGG微膠囊的貯藏提供了更好的保護條件，可以延長LGG微膠囊的貨架期。

表4 LGG微膠囊常溫條件下活菌數Table 4 Viable count of LGG microcapsules at ambient temperature（lg（CFU/g））

2.1.6 差示掃描量熱分析

由圖3可見，空白組的熔融溫度約為148 ℃，添加菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的微膠囊熔融溫度分別約為162、105、169 ℃和172 ℃，菊糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的添加有效提高了微膠囊的熔融溫度，低聚果糖降低了微膠囊的熔融溫度，可能是由于低聚果糖是菊粉部分酶解的產物，聚合度較低（2～10），熱穩定性差[30]，而添加其他3 種益生元可提高LGG微膠囊的熱穩定性，且添加水蘇糖的微膠囊熱穩定性最佳。原因為益生元能夠結合益生菌細胞膜和蛋白質結構內的水分子，導致微膠囊的熔融溫度增加[31]。Ashwar等[32]通過差示掃描量熱分析乳酸菌微膠囊的熱穩定性發現，抗性淀粉可以提高微膠囊的熱穩定性。Alehosseini等[33]研究也表明，添加益生元后雙歧桿菌BB-12微膠囊的熱穩定性更好，且與低聚果糖相比，菊粉的熔融溫度更高，對雙歧桿菌BB-12的保護效果更好，這與本研究結果一致。

圖3 不同益生元對LGG微膠囊差示掃描量熱曲線的影響Fig.3 Effects of different prebiotics on the DSC curve of LGG microcapsules

2.2 掃描電鏡分析

由圖4可見，5 組微膠囊顆粒均完整、無破裂，各組之間粒徑差距較小。這是因為5 組微膠囊的制備條件相同，所得微膠囊粒徑大小一致，經噴霧干燥的微膠囊在外觀結構上沒有明顯差異。但空白組的微膠囊凹陷較深，表面褶皺多。添加益生元后，部分微膠囊壁材表面褶皺減少，菊糖和水蘇糖微膠囊較為明顯，而壁材可以增大胃腸液、膽鹽溶液和水等的穿越阻力，從而避免其與菌體接觸，使微膠囊結構更穩定[34]，提高微膠囊對LGG的保護作用。

圖4 5 組LGG微膠囊掃描電鏡圖（×3000）Fig.4 SEM micrographs of fvie groups of LGG microcapsules (× 3000)

3 結論

以菊糖、低聚果糖、普魯蘭多糖和水蘇糖為4 種益生元，分別制備含有益生元的LGG微膠囊，以未添加益生元的LGG微膠囊為對照，探究不同益生元對微膠囊性能的影響。結果表明添加益生元提高了LGG微膠囊存活率，益生元組的LGG存活率均高于空白組，其中水蘇糖對LGG微膠囊的保護作用最強。但4 種益生元LGG微膠囊在各自條件下處理后，其穩定性不同。模擬胃腸液測試中，菊糖活菌數存活率最高，達9.5（lg（CFU/g））；在膽鹽溶液中益生元也增強了微膠囊對LGG的保護能力，其中水蘇糖的效果最佳，在膽鹽添加量0.6%條件下，空白組LGG活菌數下降4.7（lg（CFU/g）），而添加水蘇糖僅下降2.6（lg（CFU/g））；耐熱性實驗中，75 ℃、30 min后，添加水蘇糖的微膠囊耐熱性最佳，活菌數達8.7（lg（CFU/g））；在高水分活度下添加低聚果糖可有效提高微膠囊的貯藏穩定性。差示掃描量熱研究表明，菊糖、普魯蘭多糖和水蘇糖的添加有效提高了LGG微膠囊的熔融溫度，低聚果糖降低了LGG微膠囊的熔融溫度，其中水蘇糖增強了微膠囊的熱穩定性，熔融溫度達172 ℃。研究可為益生元在LGG微膠囊中的應用提供參考。