凍結過程中面筋蛋白分子結構與水分分布的原位表征與分析

張 華，張 普，張予涵，劉興麗，張艷艷

（鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450000）

我國冷凍食品行業蓬勃發展，其產值居食品工業的首位[1]。雖然冷凍保藏可以很好保持食品的新鮮度，但凍結過程對面制品品質的損傷是公認的，其中面筋蛋白網絡結構和分子結構發生變化是引起面團品質劣變的主要原因。凍結過程中，冰晶生長以及冰晶大小不均會引起面筋蛋白二硫鍵斷裂并與淀粉顆粒發生分離，導致面筋蛋白流變學性質下降，進而導致面團強度下降[2]；此外，凍結過程中水分遷移、冰晶的重結晶以及自由水含量的增加會改變面筋蛋白分子結構并破壞面筋網絡結構，導致質構性能變差，從而使面制品后續加工性能變差[3]。因此，控制凍結過程中冰晶生長對面團中面筋蛋白分子結構的損傷是提升冷凍食品加工與貯藏性能及其食用品質的關鍵所在，也是冷凍產品加工業面臨的重大科學技術難題。

面團形成過程是指面粉與水在攪拌混合過程中，面團內部的面筋蛋白與水分發生水合作用和剪切作用并伴隨著能量的輸入，從而形成包含完整面筋網絡結構并具有一定彈性和延展性的面團[4]。大量研究表明，面團形成過程中，面團加水量對面制品結構、物化性質及感官品質有很大影響[5-6]，但有關加水量對冷凍面團產品品質的影響研究較少[7]。因此，研究冷凍過程中不同水分含量面團面筋蛋白分子結構的變化規律對揭示水分含量和水分分布對冷凍面團最終品質的影響機制有重要意義。

現有的關于冷凍對面團中冰晶和蛋白分子結構影響的研究主要采用了冷凍干燥、蛋白質分離提取等樣品處理方法[8-9]。由于樣品離開了冷凍環境或采取了分離提取手段，所以測量的蛋白結構信息不能準確反映樣品的真實變化[10]。因此，對冷凍樣品采用原位表征并實時監測面筋蛋白的結構變化，有助于更加真實、準確地揭示冷凍對面筋蛋白結構變化的影響。

本研究采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀和低場核磁共振成像分析儀對凍結過程中面團面筋蛋白分子結構、水分分布和核磁共振成像的實時變化進行原位監測，從微觀尺度和分子水平揭示面團凍結過程中面筋蛋白結構和水分分布的變化規律并研究加水量對其的影響，以闡明面團凍結過程中品質劣變的機理，為控制凍結過程中面團品質劣變提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金苑精制粉（蛋白質含量11.1%，脂肪含量2%，含水量11.5%） 河南金苑糧油有限公司。

1.2 儀器與設備

HA-3480AS和面機 克萊美斯機電科技（深圳）有限公司；DZM-140電動壓片機 浙江省永康市海鷗電器有限公司；inVia激光共聚焦顯微拉曼光譜儀 英國Renishaw公司；NMI20低場核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 面團的制備

準確稱取300 g面粉4 份，分別加入面粉質量40%、45%、50%及55%的蒸餾水，置于和面機中，60 r/min攪拌10 min使其形成質地均勻的面團。使用電動壓片機反復壓延面團5 次，形成大小為30 cm×7 cm×0.8 cm、加水量分別為40%、45%、50%及55%的面團，醒發60 min后用于后續實驗。

1.3.2 面團凍結過程中拉曼光譜的原位采集

分別取大小為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的面團樣品置于冷凍平臺，將平臺固定于顯微鏡載物臺上。用激光光源進行激光聚焦，使用冷凍平臺控制系統以10 ℃/min的速率進行梯度降溫，分別在25（室溫）、0、-3、-6、-9、-12、-15 ℃和-18 ℃（凍結終點）進行拉曼光譜采集。拉曼光譜采集參數：激發波長785 nm；激光功率250 mW，使用100%的能量進行激發；掃描范圍300～4000 cm-1；數據采集時間10 s；分辨率2 cm-1。

1.3.3 低場核磁共振測定冷凍面團水分分布

參考范金磊[11]的方法并略作改動。將25、0、-3、-6、-9、-12、-15 ℃和-18 ℃的冷凍面團樣品制成高2 cm、半徑0.25 cm的圓柱體置于核磁管中，采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測定樣品的橫向弛豫時間（T2）。采集參數：回波個數1200；采樣點數166446；重復掃描16 次；半回波時間0.208 ms。

1.3.4 冷凍面團核磁共振成像分析

選用MSE（Multi Spin-Echo-Sequence）脈沖對冷凍面團進行2D質子密度成像掃描。將25、0、-3、-6、-9、-12、-15 ℃和-18 ℃的冷凍面團樣品制成高2 cm、半徑0.25 cm的圓柱體置于核磁管中，放置于磁場射頻線圈的中心，進行核磁共振成像成像，參數為：選層層厚4 mm；層間隙3 mm；重復時間300 ms；回波時間20 ms；采集次數20。使用Osiris軟件處理圖像，并以標準BMP格式保存。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 面團凍結過程中面筋蛋白分子結構的原位分析

拉曼光譜在識別分子結構以及蛋白質二、三級結構的定性與定量分析方面具有很強的技術優勢[12]。如圖1a所示，拉曼光譜中，500～550 cm-1處屬于二硫鍵（S—S），在此特征譜帶區間二硫鍵主要存在3 種構型：gauche-gauche-gauche（g-g-g）構型、gauchegauche-trans（g-g-t）構型和trans-gauche-trans（t-g-t）構型[13]，3 種構型峰面積的變化可以表征二硫鍵的變化，其特征頻率分別出現在500～510、515～525 cm-1和535～545 cm-1。拉曼光譜也可以檢測氨基酸側鏈的微環境，如圖1b所示，酪氨酸雙鏈的峰強度比值（830 cm-1和850 cm-1處，I850/830）被稱為費米共振，可以提供酚羥基氫鍵的信息[14]。1004 cm-1處的苯丙氨酸因吸收穩定可以作為歸一化因子，740 cm-1處色氨酸殘基吸收峰強度與1004 cm-1處吸收峰強度比值（I740/1004）的變化可以用來表征色氨酸殘基微環境的變化[15]。如圖1c所示，1600～1700 cm-1區間為酰胺I帶的特征峰，酰胺I帶特征峰面積的變化可以用來表征蛋白二級結構的變化。使用Peakfit 4.12軟件對拉曼圖譜進行去高斯卷積，然后進行二階導數處理，最后進行峰的歸屬。其中，α-螺旋在1645～1660 cm-1子峰，無規卷曲在1660～1670 cm-1子峰，β-折疊在1670～1680 cm-1子峰，β-轉角在1680～1690 cm-1子峰[16]。

圖1 面團拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectrum of dough

2.2 面團凍結過程中面筋蛋白二硫鍵構型的原位分析

隨著吸收頻率的升高，二硫鍵結構逐漸不穩定，g-g-g構型是穩定的二硫鍵構型，g-g-t和t-g-t構型是較不穩定的二硫鍵構型[17]。

由圖2a可知，凍結終點時，隨著加水量的增加，冷凍面團面筋蛋白二硫鍵g-g-g構型的相對含量呈先上升后下降趨勢，并在加水量45%時達到了最高，為46.97%，這代表面筋蛋白網絡結構在加水量45%時最為穩定。凍結過程中由于冰晶生長破壞了面筋蛋白的網絡結構，進而使維持面筋蛋白三級結構的二硫鍵被破壞，面筋蛋白網絡結構的持水力隨即下降，會形成更多更大的冰晶從而加劇對網絡結構的破壞；而過高的加水量使冰晶對面筋蛋白網絡結構的破壞更加劇烈，加劇了這種現象[18]。由圖2b可知，45%加水量的面團凍結過程中，二硫鍵g-g-g構型的相對含量在25～-15 ℃溫度區間無顯著變化，在-15～-18 ℃溫度區間顯著降低了4.33%。隨著溫度的下降，二硫鍵g-g-g構型向g-g-t和t-g-t不穩定構型轉變，二硫鍵的穩定性發生下降，影響了面筋蛋白的網絡結構，從而使面團品質下降。這可能是因為凍結過程中，自由水轉化為冰晶，冰晶的生長破壞了面筋蛋白的網絡結構，使分子間作用力下降，給面團的品質造成了不可逆的影響[19]。

圖2 加水量（a）和溫度（b）對冷凍面團面筋蛋白二硫鍵構型的影響Fig.2 Effects of water addition (a) and temperatures (b) on disulfide bond configuration of gluten in frozen dough

2.3 面團凍結過程中面筋蛋白氨基酸側鏈的原位分析

如表1所示，I740/1004在加水量達到45%之后趨于穩定，說明凍結終點時色氨酸殘基的微環境達到穩定的狀態，不會隨著加水量的增加而變化。這可能是因為凍結終點時，大量的水由液態轉為固態，形成的冰晶破壞了維持面筋蛋白三級結構的作用力，改變了面筋蛋白三級結構，所以加水量的增加不會影響凍結終點時氨基酸側鏈的微環境。

表1 加水量對凍結終點時冷凍面團面筋蛋白氨基酸側鏈的影響Table 1 Effect of water addition on amino acid side chains of gluten proteins in frozen dough at the end of freeze

由圖3可知，加水量45%的面團凍結過程中，隨著溫度的下降，面筋蛋白氨基酸側鏈的I740/1004值緩慢下降，表明埋藏的色氨酸在凍結過程中逐漸“暴露”，疏水基團不斷外露[20]。這是因為凍結過程中冰晶逐漸長大，破壞了蛋白的網絡結構，增大了對氫鍵的破壞，面筋蛋白三級結構隨之改變，這會使面筋蛋白的表面疏水性增大、持水性降低，從而影響面團的品質。此外，由圖1b可知，冷凍面團I850/830值遠大于普通面團中的正常值（0～1.45），推測可能是被870 cm-1處的強吸收峰掩蓋，導致結果異常[21]。

圖3 溫度對45%加水量冷凍面團面筋蛋白氨基酸側鏈的影響Fig.3 Effect of temperature on amino acid side chains of gluten proteins in frozen dough with 45% water added

2.4 面團凍結過程中面筋蛋白二級結構的原位分析

如圖4所示，在凍結終點，不同加水量冷凍面團的α-螺旋相對含量無明顯差異。45%加水量面團凍結過程中，面筋蛋白α-螺旋相對含量逐漸下降，β-折疊相對含量無顯著變化（除-9 ℃），β-轉角和無規卷曲相對含量整體呈波動上升趨勢。

圖4 加水量（a）和溫度（b）對冷凍面團面筋蛋白二級結構的影響Fig.4 Effects of water addition (a) and temperature (b) on the secondary structure of gluten in frozen dough

α-螺旋是蛋白質二級結構中較為穩定有序的結構，其含量越多，說明蛋白越穩定[22]。本實驗凍結過程中α-螺旋相對含量隨著溫度下降逐漸下降了3.63%，說明冷凍會使面筋蛋白的二級結構變得無序。這是因為隨著溫度的下降，冰晶逐漸生長，破壞了面筋蛋白的網絡結構，使氫鍵的相互作用逐漸下降。由此可知，α-螺旋逐漸轉化為無規卷曲等穩定性較低的結構，面筋蛋白的螺旋結構舒展，這會使蛋白中的疏水基團暴露，從而導致面筋蛋白的表面疏水性增大、持水性降低[23]。

2.5 面團凍結過程中水分分布的變化

共振圖譜（圖5）中出現了3 個峰并記為T21、T22和T23，當0.18 ms＜T2＜4.00 ms時，這部分水為與面筋蛋白中氨基、羧基、羥基等以氫鍵作用結合的水，流動性差，被稱為強結合水；當4.00 ms＜T2＜37.00 ms時，這部分水的流動性較結合水更弱但比自由水強，被稱為弱結合水；當T2＞37.00 ms時，這部分水為自由水[24]。此外，出峰面積代表了不同流動性水分的含量[25]。

由圖5a可知，冷凍終點時，不同加水量冷凍面團之間水分狀態無明顯差別，這可能是因為凍結過程中，淀粉被破壞，淀粉的吸水率增加，減弱了加水量對于冷凍面團水分分布的影響[26]。由圖6可知，面團中強結合水相對含量隨溫度的下降發生劇烈下降并在-6 ℃時未能檢出，弱結合水相對含量隨著溫度的下降出現先急劇升高后逐漸穩定的趨勢，自由水相對含量也在凍結過程中整體有所升高。此過程中，強結合水相對含量逐漸下降，表示凍結過程中面團的持水性逐漸減弱。推測凍結過程中，隨著冰晶的生長，非極性基團周圍的水分聚集，破壞了面筋蛋白的網絡結構，導致面團的品質發生劣變[27]。

圖5 加水量（a）和溫度（b）對冷凍面團水分分布的影響Fig.5 Effects of water addition (a) and temperature (b) on water distribution in frozen dough

圖6 面團凍結過程中強結合水（a）、弱結合水（b）和自由水（c）的相對含量變化Fig.6 Changes in relative contents of strongly bound water (a),weakly bound water (b) and free water (c) during dough freezing

2.6 面團凍結過程中核磁共振成像的變化

核磁共振成像技術能夠直觀地表現出面團在凍結過程中水分分布的變化及遷移[28]。不同加水量的面團在凍結過程中的偽彩圖如圖7所示，紅色部分越多（即氫質子信號越強）表示此部分水分含量較高，反之，藍色部分越多表示水分含量較少[29]。

圖7 面團凍結過程中加水量40%（a）、45%（b）、50%（c）、55%（d）的核磁共振成像分析Fig.7 Nuclear magnetic resonance imaging analysis of doughs with different water contents during freezing

由圖7可知，凍結過程中，水分逐漸向面團表面遷移，隨著加水量的增加，這種現象越明顯。加水量40%的面團在-15 ℃時出現明顯遷移，而加水量55%的面團在-6 ℃出現此現象。水分發生明顯遷移前，凍結過程中面團核磁共振成像出現部分區域氫質子信號明顯升高的現象：加水量40%的面團在-9 ℃時出現、加水量45%的面團、加水量50%及55%加水量面團在-3 ℃時出現。推測此時為強結合水轉化為弱結合水和自由水階段，此過程促進了冰晶的生長，冰晶生長過程中產生的熱量使水分向外遷移，從而出現氫質子信號在面團中由內向外逐漸增強的現象[30]。

3 結論

采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀和低場核磁共振成像儀對凍結過程中面團面筋蛋白分子結構、水分分布和核磁共振成像的實時變化進行原位監測，從微觀尺度和分子水平揭示面團凍結過程中面筋蛋白結構和水分分布的變化規律并研究加水量對其的影響。結果表明：面團加水量45%時，面團體系最為穩定，此時面筋蛋白二硫鍵中g-g-g構型相對含量最高，且I740/1004達到最大值0.13，氨基酸側鏈微環境最為穩定，而不同加水量之間二級結構無明顯差異。隨著溫度的下降，面團體系穩定性降低，品質持續劣變，具體表現為二硫鍵構型中較穩定的g-g-g構型逐漸轉化為較不穩定的g-g-t和t-g-t構型，I740/1004從0 ℃開始持續下降，氨基酸側鏈逐漸“暴露”于極性環境中，二級結構中較有序的α-螺旋也逐漸向無規卷曲等較無序的結構轉化。水分分布的結果也印證了這一結論，凍結過程進行的同時，強結合水相對含量持續下降，冰晶的生長迫使水分逐漸向面團表面遷移。冷凍面團品質劣變主要由冰晶生長導致的面筋蛋白網絡結構被破壞而引起，因此控制面團中加水量及水分分布是改善面團品質劣變的重要舉措。