兒茶素干預硬脂酰輔酶A去飽和酶-1表達抗小鼠肝纖維化損傷

萬 星，陶柏楠，邵文翠，金錚鈺，黃德斌，袁 林

(湖北民族大學 1.醫學部、2.風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

肝纖維化(liver fibrosis,LF)是肝臟中激活的肌成纖維細胞(主要是肝星狀細胞)分泌細胞外基質蛋白產生纖維性瘢痕的病理過程。肝纖維化若不及時治療會向肝硬化肝癌發展，最終引起死亡[1]。目前，針對肝纖維化的高效藥特別少，因此需要開發新的高效和特異性的藥物來預防或治療肝纖維化，尤其是晚期肝纖維化，即所有慢性肝病的有害下游。肝纖維化發生機制和涉及的基因眾多，但隨著社會環境及生活方式改變，非酒精性脂肪肝誘導的肝纖維化人數大量增多，在對非酒精性脂肪肝機制進行研究時，發現脂質代謝中的脂肪酸作為新機制與肝纖維化關系密切，如：脂肪酸可影響肝星狀細胞凋亡[2]，肝星狀細胞活化釋放基質需要巨大能量，為了滿足這一需求，肝星狀細胞發生代謝重編程，包括warburg效應、脂質代謝增加等[3-4]。因此，本研究著重探討兒茶素(catechin,CA)對脂質代謝這一新機制的影響，CA最早在茶葉中被提取研究，后研究人員發現其存在多種中草藥中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護心血管等作用[5～7]。課題組在前期研究鬼箭羽醇提物抗肝纖維化功效時，發現CA抗纖維化的效能極高[8]，后通過基因芯片篩查差異性基因，硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1)引起我們關注，SCD1是脂肪酸代謝限速酶，催化飽和脂肪酸變成單不飽和脂肪酸，影響脂質代謝[9-10]，加之文獻報導CA可干擾脂質代謝抗酒精性脂肪肝[11]，因此，我們合理提出假說：CA可能通過影響SCD1表達干擾脂質生成抗肝纖維化，通過實驗論證，為進一步討論CA抗肝纖維化機制奠定基礎并為LF治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物C57BL /6 小鼠，♂，體質量(18±2) g，SPF級，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 藥物與試劑(+)-兒茶素(上海源葉生物，LOT：P20O7F23087)；CCl4(國藥集團化學試劑有限公司，臨用前溶于橄欖油)；AST/ALT試劑盒(南京建成，AST批號：20201219，ALT批號：20201221)；TG試劑盒(南京建成，批號：20210603)；鼠SCD1(英國Abcam，LOT:GR3297026-12)；內參GAPDH一抗和二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser(日本Takara，LOT:AJ60796A)、TB Greenpremix EX TaqTMⅡ(日本TaKaRa，LOT：AI62517A)；油紅O套盒(Biossci,BP037)。

1.3 儀器顯微鏡(Nikon E200，日本)；酶標儀(Thermo Scientific Multiskan GO，美國)；蛋白電泳電轉儀(Bio-Rad，美國)；冰凍切片機(Thermo，美國)；正置顯微鏡(Olympus CX-31，日本)。

1.4 方法

1.4.1藥物配制 CA濃度400、200、100 mg·kg-1。稱取500 mg CA加生理鹽水31.25 mL配成高劑量16 g·L-1，稱取500 mg CA加生理鹽水62.5 mL配成中劑量8 g·L-1，在配好的中劑量中取15 mL加生理鹽水稀釋至30 mL配成低劑量4 g·L-1，水飛薊賓給藥劑量200 mg·kg-1，按上述方法配成8 g·L-1。每管溶液約為8只小鼠1周的使用量。

1.4.2實驗分組與模型 小鼠適應性喂養后，隨機分為6組：對照組(normal group,NG)、CCl4組、100 mg·kg-1CA組(CA-L)、200 mg·kg-1CA組(CA-M)、400 mg·kg-1CA組(CA-H)、200 mg·kg-1水飛薊賓組(Sil)。模型組小鼠腹腔注射含 25% CCl4的橄欖油溶液 1.6 mL·kg-1，每周 2 次，共6周。藥物組在造模同時，前3周給小鼠灌胃CA和水飛薊賓，每次灌0.5 mL，正常組灌胃等體積生理鹽水。所有小鼠6周后禁食不禁水，24 h后處死，按要求做后續操作。

1.4.3肝臟外觀和肝指數測定 稱質量，小鼠眼球采血，頸椎脫臼處死，取出肝臟，用高倍相機在同背景同視野下拍大體形態。肝指數/%=肝臟質量(g) /體質量(g)×100%。

1.4.4血清學指標 ALT、AST、TG按照南京建成試劑盒說明書操作。

1.4.5HE染色、Masson染色、α-SMA和Collagen Ⅰ免疫組織化學 參照本課題組已發表文章[8]。

1.4.6油紅O染色 10%甲醛固定標本，冰凍切片，厚約6～10 μm,蒸餾水稍洗；將固定好的切片入60%異丙醇中漂洗30 s，取油紅O儲備液6 mL，加蒸餾水4 mL，混合后靜置10 min，即可用來染色，染色時間8 min，60%異丙醇稍洗去多余染液，蒸餾水洗；用濾紙將切片周圍水分抹干，專用封片劑進行封片。

1.4.7QPCR檢測SCD1的表達 約稱取30 mg小鼠肝臟，加1 mL TRIzol研磨，靜置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1，離心8 min，取800 μL上清，加160 μL氯仿，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1,離心10 min，取400 μL上清轉移至無RNA酶的EP管，加等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1,離心15 min，倒掉上清，扣干，加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，12 000 r·min-1,離心10 min，倒掉上清，扣干，風干。按照試劑盒說明書逆轉錄1 000 ng RNA，再進行40循環的PCR，SCD1引物：F:5′-TTCGTTGCCACTTTCTTGCG-3′，R:5′-AAGTTGATGTGCCAGCGGTA-3′，GAPDH引物：F:5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′,R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。以2-ΔΔCt計算表達。

1.4.8Western blot檢測SCD1的表達 參照本課題組已發表文章[8]，SCD1一抗濃度1 ∶1 000，二抗濃度1 ∶10 000。

1.4.9分子對接技術檢測CA與SCD1的互作 用Schrodinger先畫出2D結構的CA，再轉變成3D結構的CA，用CHARMm力場對受體結構進行優化；靶點蛋白的晶體結構利用Discovery Studio中的BLAST Search(DS Server)模塊獲得，然后使用cdocker方法執行分子對接，并使用Discovery Studio的智能最小化器最小化算法進行最小化，在計算結束時保存每個配體的十個得分最高的構象，最后，對CA化合物與SCD1的結合物進行自由能計算。

2 結果

2.1 CA對肝纖維化小鼠肝指數的影響肝纖維化會損傷肝臟。肝腫脹是肝損指標之一，肝指數可部分反應肝臟腫脹程度。CCl4組肝指數高于正常組(P<0.01)，不同濃度CA量效依賴地降低CCl4引起地肝指數升高(P<0.01)，水飛薊賓也降低了CCl4引起地肝指數升高(P<0.01)，同劑量CA和水飛薊賓的作用無差異，見Fig 1。

2.2 CA對對肝纖維化小鼠肝臟形態的影響肝臟受損還可通過顏色、表面光滑度、組織結構來觀察。HE染色可以觀察炎癥水腫、組織結構異常。正常組小鼠肝臟表面光滑，無褶皺，呈紅褐色，肝小葉結構正常，CCl4組小鼠肝臟表面出現凹陷褶皺，泛白，出現明顯水腫，有炎癥浸潤，肝小葉被破壞，假小葉生成，CA組呈濃度梯度地減少泛白水腫和炎性浸潤，Sil組也減少水腫、炎癥，減少肝損，相同劑量CA和Sil作用無差別，見Fig 2。

2.3 CA對肝纖維化小鼠血清學指標的影響ALT、AST是肝損金指標。肝纖維化越嚴重對肝臟損害越大。CCl4組較正常組ALT、AST明顯升高(P<0.01)，CA可量效依賴地降低其表達(P<0.01)，Sil也可降低其表達(P<0.01)，同劑量CA降低數值大于Sil，但差異無統計學意義(P>0.05)，見Fig 3。

Fig 1 Effect of different doses of CA and **P<0.01 vs NG;#P<0.05 vs CCl4,##P<0.01 vs CCl4

Fig 2 Effect of different doses of CA and Sil on liver morphology and HE staining A:liver morphology,B：HE staining

2.4 CA對肝纖維化小鼠α-SMA和細胞外基質膠原的影響肝星狀細胞的激活是肝纖維化的關鍵，α-SMA是星狀細胞激活的標志，CollagenⅠ是肝星狀細胞激活后釋放的主要的細胞外基質。利用免疫組織化學技術檢測α-SMA和CollagenⅠ的表達，可反映肝纖維化的程度。CCl4組α-SMA和CollagenⅠ明顯升高(P<0.01)，CA可量效依賴地降低二者的表達，Sil也可以減少其表達(P<0.01)。為了證明細胞外基質膠原的變化，同時使用了Masson染色觀察膠原堆積，正常組無膠原生成，CCl4組大量膠原生成，CA組呈濃度梯度地減少膠原生成，Sil組也減少膠原的生成，相同劑量CA和Sil作用無差別，見Fig 4。

Fig 3 Effect of different doses of CA and Sil on ALT and AST **P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

2.5 CA對肝纖維化小鼠脂質的影響為檢測肝纖維化時脂質變化，我們采用油紅O染色檢測脂質堆積情況，試劑盒檢測甘油三酯生成。CCl4組較正常組脂質明顯增多，CA量效依賴地降低脂質合成，Sil也降低脂質合成；為了進一步量化脂質含量，檢測了血清中TG含量，CCl4組較正常組TG明顯增多(P<0.01)，CA量效依賴地降低TG合成，Sil也降低TG合成(P<0.01)，同劑量CA降低地數值更多，但差異無統計學意義，見Fig 5、Fig 6。

2.6 CA對肝纖維化小鼠SCD1的影響CCl4組中小鼠肝臟脂質發生變化，而SCD1是脂質代謝的限速酶，于是利用QPCR和Western blot實驗分別檢測SCD1mRNA和蛋白的變化，發現CCl4組中SCD1在mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.01)，CA量效依賴地降低其表達，Sil也降低其表達(P<0.01)，同劑量CA和Sil對SCD1的結果差異無統計學意義，見Fig 7。

2.7 CA與SCD1的作用方式為了弄清CA是否能靶向作用SCD1蛋白，在上述結果的基礎上，利用分子對接技術，初步檢測CA與SCD1是否存在直接作用并為后續實驗奠定基礎。結果發現CA與SCD1的結合親和力較高(-5.4 kcal·mol-1)，觀察到SCD1有4個氫鍵(Arg74,Asn148,Trp184和Val187)，還有6個氨基酸通過范德華力和CA相互作用，CA-SCD1的復合物通過在CA與SCD1氨基酸殘基之間形成非共價相互作用而穩定，見Fig 8。

Fig 4 Effect of different doses of CA and Sil on expression of α-SMA,collagen I by IHC and Masson staining

Fig 5 Effect of different doses of CA and Sil on lipid in oil red O staining

Fig 6 Effect of different doses of CA and Sil on TG n=8)**P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

3 討論

肝纖維化治療方法主要包括病因治療、抗纖維化藥物、原位肝移植、細胞療法及中醫治療等[12]。課題組在前期研究鬼箭羽醇提物時發現CA具有良好抗纖維化能力，可激活TGFβ-Smad信號通路，為了進一步探討其機制，做了正常組、模型組和藥物組基因芯片篩查，篩出系列基因。在研究非酒精性脂肪肝機制時，發現脂質中的脂肪酸對非酒精性脂肪肝引起的肝纖維化意義重大，而芯片結果中SCD1基因恰好是脂肪酸代謝限速酶，可影響脂肪酸含量影響脂質代謝，因此，我們提出假說：CA是否能作用SCD1干擾脂質生成抗肝纖維化？為了驗證假說，本研究完成以下內容：

Fig 7 Effect of different doses of CA and Sil on expression of n=8)A:SCD1 mRNA,B:SCD1 protein bands,C:SCD1 protein statistical chart.**P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

Fig 8 Binding site and mode of CA to SCD1

首先，驗證CA抗肝纖維化作用。肝纖維化導致肝臟損傷，所以同時檢測了肝損指標：肝指數、ALT、AST和肝纖維化標志：α-SMA和Collagen Ⅰ，結果提示CCl4可增高上述指標的表達，誘發肝纖維化，CA可量效依賴地降低其表達，減輕肝纖維化的發生，同時，HE染色進一步說明CCl4導致肝臟損傷，CA減輕損傷，Masson染色顯示，CA可減輕膠原堆積，結論一致。

其次，驗證肝纖維化時脂質改變及藥物作用。油紅O染色可檢測脂質生成，結果提示CCl4組脂質明顯增多，CA可量效依賴地減少脂質生成，TG是脂質重要組成成分，CCl4組TG明顯增多，CA可量效依賴地減少TG生成，兩項指標初步證實脂質參與肝纖維化的發生，CA可干擾脂質生成。

SCD1是一種內質網酶，是脂肪酸從頭合成途徑中最終步驟的限速酶[16,10]，脂肪酸合成是脂質代謝的重要環節，結果顯示，CCl4增加SCD1mRNA和蛋白的表達，CA量效依賴地降低其表達，表明CA可影響SCD1的表達。CA和SCD1的作用關系和模式：CA與SCD1的結合能為- 5.4 kcal·mol-1，小于0，表明親和力較強，CA可通過氫鍵和范德華力與SCD1直接作用。

另，文中使用陽性對照水飛薊賓，發現在同等中劑量下，CA抗纖維化能力統計學無差異，表明中劑量CA與水飛薊賓抗纖維化能力相同。綜上，CA可影響SCD1并通過模擬表明兩者有直接作用，但CA是否通過靶向SCD1發揮作用需進一步實驗，同時CA減少脂質生成，是通過SCD1干擾脂肪酸從頭合成途徑還是其它路徑，也需進一步研究。