黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠肝腎損傷改善和腸道菌群結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的作用

邢喜平，何玉林，薛 娜，顏春魯，伍志偉,

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

鎘是自然界中含量豐富、分布廣泛的一種重金屬元素，同時(shí)，鎘及其化合物也是一類重要的重金屬污染物，可通過氧化應(yīng)激[1]等方式引起人和動(dòng)物腎臟[2]、肝臟[3]、骨[4]等多種組織器官的炎性反應(yīng)和功能紊亂[5]。飲食是人體鎘暴露的最主要途徑，經(jīng)飲食攝入的含Cd食物和/或水進(jìn)入腸道后，被腸道上皮細(xì)胞吸收，在腸上皮細(xì)胞的頂膜處通過質(zhì)子-金屬共轉(zhuǎn)運(yùn)體二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1(divalent metalion tranxporter-1，DMT1)、鈣-ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)子、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)子等轉(zhuǎn)運(yùn)體的介導(dǎo)進(jìn)入體液循環(huán)并散布于人體的不同組織與器官，逐步造成相應(yīng)組織和器官的鎘蓄積。沉積在細(xì)胞中的鎘離子可與含羥基、巰基、氨基的蛋白分子結(jié)合形成鎘-蛋白質(zhì)復(fù)合物，或通過鎘與鈣、鋅競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等多種酶的活性，引起細(xì)胞氧化損傷、代謝紊亂和凋亡[6]，然而，鎘暴露引起人和動(dòng)物中毒具體機(jī)制依然不清。

鎘的攝入不僅會(huì)對(duì)人和動(dòng)物肝、腎、睪丸等造成損傷，也會(huì)通過氧化損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫病理等途徑對(duì)腸道造成影響。腸道菌群作為腸道的重要組成部分，在調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡、維持機(jī)體健康、有效清除和促進(jìn)體內(nèi)重金屬排泄方面發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，低劑量鎘暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，引起腸壁通透性增強(qiáng)和調(diào)節(jié)部分肝臟基因的表達(dá)水平，造成雄性小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪堆積，同時(shí)，重金屬暴露時(shí)間長(zhǎng)短與腸道菌群變化程度呈正向關(guān)[7]。

目前，對(duì)于鎘中毒的治療以乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、1,2-二巰基丙醇(2,3-dimercaptopropanol，BAL)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(diethyl dithiocarbamate，DDTC)螯合劑類藥物為主。近年來，以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，應(yīng)用中藥復(fù)方、單味中藥或組分在治療鎘中毒方面取得了長(zhǎng)足發(fā)展和明顯療效，但其機(jī)制尚不清楚。

本研究采用CdCl2腹腔注射法建立鎘染毒W(wǎng)istar大鼠模型，以具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等功效的黃芪多糖為調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)軟件分析其對(duì)鎘中毒大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，以期從腸道菌群的角度揭示黃芪多糖對(duì)鎘造成肝腎損傷的改善。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002，使用許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理程序符合相關(guān)倫理要求，得到甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器黃芪多糖由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心藥物制劑實(shí)驗(yàn)室提取(純度50%以上)；糞便基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)公司(DP180523)；CdCl2購自天津市巴斯夫化工公司(20161010)；鎘標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液(100 mg·L-1)購自廈門海標(biāo)科技公司(2018324)。

1-14K高速低溫冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；CP214精密電子天秤，美國(guó)OHAUS儀器有限公司；Illumina PE250測(cè)序系統(tǒng)，美國(guó)Illumina公司；ZEENIT700石墨爐原子吸收光譜儀，德國(guó)Analytikjena公司。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物分組與造模 40只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(BC)、黃芪多糖組(APS)、CdCl2組(CD)、黃芪多糖+CdCl2組(APS+CD)，每組10只，分籠飼養(yǎng)。SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(20～25) ℃，濕度40.0%～50.0%，12 h·d-1采光，自由攝食和飲水。

BC和APS組小鼠以0.9%無菌生理鹽水腹腔注射(2 mL·d-1)，其余各組腹腔注射CdCl2水溶液(1.5 mg·kg-1·d-1)，每周5次，持續(xù)處理5周，以建立鎘染毒大鼠模型[8]。

1.3.2動(dòng)物給藥 CD和APS+CD組于每次腹腔注射CdCl2前2 h，分別以生理鹽水和20 mg·kg-1·d-1黃芪多糖灌胃[19]；BC和APS于每次腹腔注射0.9%生理鹽水前2 h，分別以生理鹽水和20 mg·kg-1·d-1黃芪多糖灌胃；每日1次，持續(xù)處理5周。

1.3.3鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.1 mL鎘標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液(100 mg·L-1)于100 mL容量瓶，用1% HNO3定容、稀釋成濃度為100 μg·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液。吸取0.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0 μL鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別置于100 mL容量瓶，用1% HNO3定容、稀釋成濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)工作液；應(yīng)用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定其吸光度[9]。

1.3.4尿量及尿鎘檢測(cè) 于每周末次灌胃結(jié)束后，將動(dòng)物單獨(dú)置于代謝籠中，收集24 h尿液和測(cè)量體積，連續(xù)進(jìn)行5周；應(yīng)用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定尿液中鎘的含量[9]。

1.3.5肝腎中鎘殘留檢測(cè) 末次藥物和染毒處理24 h后，采用CO2窒息法處死大鼠，解剖、收集大鼠肝臟和腎臟。采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定組織中鎘的含量[9]。

1.3.6肝腎病理學(xué)組織學(xué)檢查 切取解剖后大鼠部分肝腎組織，以無菌生理鹽水浸洗，經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后，采用HE染色法觀察各組大鼠肝臟、腎臟組織病理變化。

1.3.7DNA的提取、PCR檢測(cè)和測(cè)序 建模結(jié)束前24 h，每只大鼠隨機(jī)無菌收集新鮮糞便4粒，經(jīng)搗碎、混合均勻后，應(yīng)用QIAamp糞便總DNA提取試劑盒提取糞便總DNA，具體操作參照說明書；樣品總DNA 16S rDNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增與反應(yīng)參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)分析后，采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶；回收產(chǎn)物通過QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)定量分析，符合標(biāo)準(zhǔn)的純化回收產(chǎn)物送上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行Illumina PE250測(cè)序。

1.3.8生物信息學(xué)分析 Illumina PE250測(cè)序所得PE reads經(jīng)overlap關(guān)系拼接、質(zhì)控和過濾后，應(yīng)用UPARSE 7.1軟件在97%相似性原則下進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU聚類分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析和測(cè)序深度檢測(cè)；基于GreenGene數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)和物種注釋，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程的建立以ZEENIT700石墨爐原子吸收光譜儀測(cè)得的吸光度(A)為縱標(biāo)準(zhǔn)、鎘標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線(Fig 1)，根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)和曲線計(jì)算得到回歸方程Y=0.0129X+5.0×10-5和相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。由此表明，濃度在0.5～3.0 μg·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)工作液吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

Fig 1 Cadmium standard curve obtained by calculation

2.2 尿量與尿鎘含量分析1～5周各組大鼠尿量的收集分析表明，正常大鼠(BC)24 h的平均尿量約為10.6 mL；腹腔注射0.1% CdCl2后，尿量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，在第4～5周時(shí)基本保持穩(wěn)定，與BC相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，鎘染毒大鼠尿量回升，與CD相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。由此可見，黃芪多糖具有緩解鎘暴露大鼠尿量減少的作用，見Tab 1。

1～5周各組大鼠尿鎘含量檢測(cè)結(jié)果如Tab 2所示，BC大鼠的尿鎘含量約為1.07 μg·L-1，與APS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腹腔注射CdCl2后，CD和APS+CD大鼠尿鎘含量隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，在第4周時(shí)達(dá)到峰值并保持相對(duì)穩(wěn)定，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與BC相比，差異極明顯(P<0.01)。由此可見，黃芪多糖灌胃對(duì)鎘染毒大鼠尿鎘含量影響不明顯，但可通過利尿作用促進(jìn)體內(nèi)鎘的排除。

2.3 腎臟與肝臟鎘蓄積分析實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟和肝臟中鎘含量的石墨爐原子吸收光譜顯示，鎘染毒大鼠(CD)腎臟和肝臟鎘含量明顯增加，與BC和APS相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，APS+CD腎臟和肝臟中鎘含量均下降，與CD相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見Tab 3。由此可見，黃芪多糖具有降低大鼠肝臟和腎臟中含量的功效。

2.4 大鼠肝腎組織病理學(xué)分析

2.4.1肝組織病理學(xué)分析 HE染色顯示，BC和APS組肝細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，胞核輪廓清晰分明，肝小葉清晰可見，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇正常(Fig 2A，2C)；腹腔注射CdCl2后，肝細(xì)胞腫脹，部分區(qū)域呈現(xiàn)片狀壞死，胞核著色較淺，肝小葉邊界不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖Fig 2B)；黃芪多糖灌胃處理后，部分肝細(xì)胞腫脹壞死，細(xì)胞輪廓可見，胞核著色加深，肝竇走向正常、清晰，呈放射狀(Fig 2D)。

2.4.2腎組織病理學(xué)分析 HE染色鏡檢顯示，BC和APS組腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，管腔完整，胞核清晰可見、大小均一(Fig 3A，3C)；腹腔注射CdCl2后，CD腎組織細(xì)胞腫脹、壞死，腎小管結(jié)構(gòu)不完整，管腔內(nèi)出現(xiàn)蛋白樣沉淀，腎小球萎縮，細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 3B)；APS灌胃處理后，APS+CD腎組織細(xì)胞腫脹、壞死減輕，腎小管結(jié)構(gòu)趨于完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和空泡減少，腎組織損傷改善明顯(Fig 3D)。

Tab 1 Effect of astragalus polysaccharides on urine volume of cadmium exposed n=10)

Tab 2 Effect of astragalus polysaccharides on cadmium content in urine of cadmium-exposed n=10)

Tab 3 Effect of astragalus polysaccharides on cadmium content in kidney and liver of cadmium-exposed n=10)

Fig 2 Histopathological examination of liverA：BC，B：CD，C：APS，D：APS+CD(×200)

Fig 3 Histopathological examination of kidneyA：BC，B：CD，C：APS，D：APS+CD(×200)

2.5 黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠腸道菌群的影響

2.5.1OTUs聚類分析 原始序列經(jīng)數(shù)據(jù)過濾篩選獲得優(yōu)質(zhì)序列662 513條，平均長(zhǎng)度為420 bp，占總序列數(shù)的99.87%。按照97%相似性原則對(duì)優(yōu)質(zhì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類分析，4組測(cè)序樣品共得到1408個(gè)OTU，其中BC為356個(gè)、CD為332個(gè)、APS為372個(gè)、APS+CD為348；4組共有OTU為223個(gè)；BC、CD、APS和APS+CD獨(dú)有OTU數(shù)分別為17、14、11和6，F(xiàn)ig 4提示，黃芪多糖灌胃有逆轉(zhuǎn)CdCl2注射引起的大鼠腸道菌群多樣性減少的作用。

Fig 4 Venn analysis of OTU existing in BC,CD,APS,and APS+CD

2.5.2Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是基于樣本中OTU分類和序列數(shù)，通過計(jì)算Chao1、ace、shannon和simpson指數(shù)反映樣品中物種豐富度和均勻度的一種分析方法。Chao1和ace指數(shù)通常能反映樣本物種的相對(duì)豐度，即OTU的數(shù)目；shannon和simpson指數(shù)反映腸道細(xì)菌群落的多樣性，shannon指數(shù)越大、simpson指數(shù)越小，表明樣品物種多樣性越高。腹腔注射CdCl2后，大鼠chao1、ace、shannon指數(shù)明顯降低，simpson指數(shù)明顯升高，與BC相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)與黃芪多糖合并處理后，鎘染毒大鼠樣本chao1、ace、shannon指數(shù)明顯回升、simpson指數(shù)明顯回落(P<0.05)。數(shù)據(jù)表明，黃芪多糖提升了鎘染毒大鼠腸道細(xì)菌的相對(duì)豐度和多樣性，F(xiàn)ig 5。

2.5.3β多樣性分析 β多樣性主要用于分析不同樣本間腸道菌群組成的相似性。采用NMDS法對(duì)各樣本數(shù)據(jù)的β多樣性分析顯示，同一組別的重復(fù)樣本距離較近，聚集在一起；不同組別明顯分布于由NMDS1和NMDS2組成二維平面圖的不同區(qū)域，表明各組之間腸道菌群結(jié)構(gòu)區(qū)分明顯(Fig 6)。不同組別重復(fù)樣本的PCoA分析顯示，腹腔注射CdCl2后，CD與BC間距離拉大，經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，APS+CD與BC之間距離拉近(Fig 6)，表明黃芪多糖具有調(diào)節(jié)鎘暴露大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)向正常組過渡的作用。

Fig 5 Alpha diversity index (Chao,ace,Shannon and Simpson) analysis

Fig 6 Analysis of different samples by NMDS (A) and PCoA (B) methods

2.5.4腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性分析

2.5.4.1門水平分析 按照0.97的相似性比對(duì)原則，經(jīng)OUT注釋分析表明，4組樣本共獲得11個(gè)菌門，分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、CandidatusSaccharibacteria、柔膜菌門(Tenericutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、螺旋體門(Spirochaetes)和迷蹤菌門(Elusimicrobia)；各樣本優(yōu)勢(shì)菌門均為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria，三者之和占比均在96%以上。與BC比較，腹腔注射CdCl2后，Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres豐度明顯下降，F(xiàn)usobacteria和Actinobacteria豐度增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；經(jīng)黃芪多糖灌胃后，鎘染毒大鼠腸道中Firmicutes豐度極明顯下降，Bacteroidetes、Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres明顯增加(P<0.05或P<0.01)，F(xiàn)usobacteria在腸道中消失，出現(xiàn)Acidobacteria、Spirochaetes和Tenericutes，F(xiàn)ig 7A。

2.5.4.2屬水平分析 16份樣本共包含62個(gè)菌屬，Prevotella、Ruminococcus、Oscillibacter、Bacteroides、Flavonifractor、ClostridiumXlVa和Roseburia均為各樣品優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度占總數(shù)的70%以上。腹腔注射CdCl2后，Ruminococcus、Bacteroides、Flavonifractor、Roseburia和Elusimicrobium豐度明顯下降，Lactobacillus、Lachnospiracea_incertae_sedis、Parasutterella、ClostridiumXlVb、ClostridiumXI、Intestinimonas和Fusobacterium豐度明顯上升，與BC相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；黃芪多糖灌胃后，鎘染毒大鼠腸道中Prevotella、Bacteroides、Parasutterella、Elusimicrobium和Barnesiella豐度明顯上升，Ruminococcus、Oscillibacter、Flavonifractor、ClostridiumXlVa、Roseburia、Lactobacillus、Ruminococcus2、Lachnospiracea_incertae_sedis、ClostridiumIV、ClostridiumXlVb、ClostridiumXI和Intestinimonas明顯下降，同時(shí)出現(xiàn)了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，但Fusobacterium消失，與CD相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，F(xiàn)ig 7B。

3 討論

鎘經(jīng)消化道、皮膚、血液、淋巴液到達(dá)肝臟和腎臟后，在其內(nèi)大量蓄積，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞變性、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞空泡化、功能性蛋白失活、氧化壓力和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等多種途徑，導(dǎo)致部分肝腎組織缺血、細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核仁功能紊亂及炎性損傷[11]。在病理學(xué)上表現(xiàn)為，肝細(xì)胞腫脹、壞死，胞核著色較淺，肝小葉邊界不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[12]；腎臟表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞腫脹、壞死，管腔內(nèi)出現(xiàn)蛋白樣沉淀，腎小球萎縮，細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[11]。本研究中，鎘染毒大鼠肝臟和腎臟HE染色結(jié)果與上述結(jié)論一致。同時(shí)，課題組前提研究表明，鎘染毒后肝腎組織中MDA含量升高、SOD 活性降低、IL-2水平下降，提示肝腎組織的氧化壓力和炎性反應(yīng)增強(qiáng)[8]。

黃芪多糖為中藥黃芪的重要活性成分，可通過抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、利水等作用改善和保護(hù)鎘中毒引起的肝腎損傷[13]。課題組前期研究證實(shí)，黃芪多糖灌胃可使鎘染毒大鼠肝腎組織中MDA含量下降、SOD活性增加、IL-2水平升高[11]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，鎘染毒大鼠肝腎組織中鎘含量明顯下降、尿量增加、病理損傷減輕，兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)黃芪多糖可通過上述作用改善由鎘暴露引起的肝腎損傷，但其發(fā)生的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

近年來，隨著腸道微生態(tài)研究的逐步深入，微生態(tài)作為機(jī)體的重要組織器官，其結(jié)構(gòu)和功能得到進(jìn)一步揭示[14]。中藥來源的多糖既是人體所需的重要能量物質(zhì)和疾病治療的必要藥物組分，也是腸道菌群的天然底物。已有研究表明，藜麥多糖、人參多糖、麥冬多糖等以底物誘導(dǎo)的方式調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，同時(shí)腸道菌群亦可通過底物代謝產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡和維持機(jī)體健康[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過黃芪多糖灌胃處理正常大鼠后，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生了較大的變化。從門水平而言，F(xiàn)irmicutes和Fusobacteria豐度明顯下降，Bacteroidetes、Proteobacteria和Fibrobacteres明顯增加，Elusimicrobia消失，CandidatusSaccharibacteria、Acidobacteria、Tenericutes和Spirochaetes顯現(xiàn)。從屬水平而言，Prevotella、Bacteroides和Parasutterella豐度明顯上升，Ruminococcus、Oscillibacter、Flavonifractor、Roseburia、Lactobacillus、ClostridiumIV和ClostridiumXI明顯下降，同時(shí)出現(xiàn)了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，但Fusobacterium消失。這一結(jié)果與吳莉等[16]基本一致。

鎘具有較強(qiáng)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)作用，低劑量鎘的攝入就會(huì)引起腸壁細(xì)胞和蓄積組織或器官的代謝、分泌等功能異常，從而抑制菌群生長(zhǎng)和降低細(xì)菌豐度，導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)及穩(wěn)態(tài)破壞，影響細(xì)菌排除體內(nèi)有害物質(zhì)和金屬離子的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，從門水平而言，CdCl2的攝入明顯抑制了Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres細(xì)菌的生長(zhǎng)，相應(yīng)細(xì)菌豐度下降，但促進(jìn)了Fusobacteria和Actinobacteria生長(zhǎng)，相應(yīng)細(xì)菌豐度增加；從屬水平而言，Ruminococcus、Bacteroides、Flavonifractor、Roseburia和Elusimicrobium細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制，相應(yīng)細(xì)菌豐度下降，但Lactobacillus、Lachnospiracea_incertae_sedis、Parasutterella、Clostridium XlVb、Clostridium XI、Intestinimonas和Fusobacterium細(xì)菌生長(zhǎng)得到促進(jìn)，細(xì)菌豐度上升。由此可見，鎘明顯影響了腸道菌群的結(jié)構(gòu)和細(xì)菌豐度，對(duì)肝腎造成了嚴(yán)重的損傷。

Fig 7 Relative abundances of top 10 phyla (A) and 20 genera (B) in each sample

經(jīng)黃芪多糖灌胃后，從門水平而言，鎘染毒大鼠腸道中Firmicutes細(xì)菌生長(zhǎng)被限制，細(xì)菌豐度回落，Bacteroidetes、Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres細(xì)菌得到促進(jìn)，細(xì)菌豐度回升；同時(shí)，F(xiàn)usobacteria在腸道中消失，出現(xiàn)了Acidobacteria、Spirochaetes和Tenericutes細(xì)菌。從屬水平而言，Prevotella、Bacteroides、Parasutterella、Elusimicrobium和Barnesiella細(xì)菌生長(zhǎng)被促進(jìn)、豐度回升，Ruminococcus、Oscillibacter、Flavonifractor、Clostridium XlVa、Roseburia、Lactobacillus、Ruminococcus2、Lachnospiracea_incertae_sedis、Clostridium IV、Clostridium XlVb、Clostridium XI和Intestinimonas細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制、豐度明顯回落；同時(shí)，出現(xiàn)了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，但Fusobacterium消失。由此可見，黃芪多糖可在一定程度上通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來改善鎘染毒大鼠的肝腎損傷。

總之，黃芪多糖和鎘的攝入均可改變大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與多樣性。然而菌群結(jié)構(gòu)的變化在不同的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告中并不具有嚴(yán)格的規(guī)律性或一致性，其數(shù)據(jù)差異來源可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物異質(zhì)性、飼養(yǎng)方式、腸道菌群的原始組成、鎘的注射劑量、處理時(shí)間、DNA提取方式、測(cè)序技術(shù)平臺(tái)和分析設(shè)定參數(shù)等因素有關(guān)。目前，鎘染毒實(shí)驗(yàn)多選用大鼠、小鼠、家兔等為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以吸入、飲食和腹腔注射的方式建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在本研究中，選用與人親緣關(guān)系較近的嚙類動(dòng)物—大鼠，采用腹腔注射的方式能夠快速、準(zhǔn)確、科學(xué)地建立鎘染毒大鼠動(dòng)物模型，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作中盡量減少由于上述因素帶來的偏差。雖然腹腔注射能夠有效控制小鼠攝入體內(nèi)的鎘劑量和快速建立動(dòng)物模型，但無法完全切實(shí)模擬人體正常攝入重金屬鎘的方式，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果在不同的實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)一定的偏差。

腹腔注射CdCl2后，重金屬鎘可通過腸壁吸收、體液輸送至腸腔、肝臟和腎臟，引起機(jī)體組織功能分泌異常，從而直接或間接導(dǎo)致大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)生理平衡狀態(tài)破壞，使得有害菌的種類和數(shù)量增加，有益菌的種類和數(shù)量相對(duì)減少或消失，嚴(yán)重抑制了菌群解毒和排毒的功能。隨著重金屬污染程度的日益加劇，采用重金屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型從腸道菌群結(jié)構(gòu)角度揭密鎘暴露對(duì)人體組織器官的功能危害的機(jī)制顯得尤為必要。然而，目前對(duì)于鎘中毒的治療及體內(nèi)蓄積鎘的驅(qū)除，多采用具有吸附功能的螯合劑藥物，通過螯合方式排出體外，但其仍然存在一定的安全性與有效性隱患。天然藥物或其組分具有調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)能力強(qiáng)、解毒作用明確、來源廣泛、毒副作用小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，而成為目前預(yù)防重金屬中毒的重要研發(fā)焦點(diǎn)。