沙利度胺在大鼠炎癥性腸病模型中藥動學研究

李亞港，姜福林，李一萍，黃 民，鐘國平

(1.中山大學藥學院藥物代謝與藥動學實驗室；2.廣東省創新藥物藥代動力學研究與評價重點實驗室，廣東 廣州 510006)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎等至少兩種獨立疾病。過去10年，IBD在全球范圍內呈現發病率上升的趨勢[1]。目前IBD的發病原因尚不清楚，且難以治愈，因此IBD的治療主要以緩解癥狀與防治并發癥為目的，一些炎癥調控因子[2]和中藥單體[3]在緩解IBD癥狀中表現出潛力，但未應用于臨床實踐，目前臨床應用于IBD的藥物包括氨基水楊酸類、糖皮質激素類、免疫調節劑等藥物。沙利度胺作為免疫調節劑，兼有抑制血管生成作用，且價格低廉，已用于IBD的臨床維持緩解治療[4]，并且表現出顯著療效[5]。

由于沙利度胺溶解性差，在水中穩定性差，因此市售沙利度胺多為固體制劑，給藥途徑以口服為主。胃腸道是口服藥物的主要吸收部位，胃腸功能的改變可能對藥物的吸收產生影響，從而影響到藥物的安全性和有效性。IBD在組織學中表現為粘膜破壞、炎癥細胞浸潤和息肉、腫塊的形成等，但對沙利度胺口服吸收的影響尚不明確。因此，本研究擬分別使用健康大鼠與IBD大鼠進行沙利度胺藥代動力學的研究，為沙利度胺的合理使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑沙利度胺標準品(Sigma-Aldrich，純度>96%)，7-羥基香豆素(Sigma-H24003，純度>99%)，2,4,6-三硝基苯磺酸(Sigma-Aldrich，5%)，無水乙醇(TEDIA，分析純)，乙酸乙酯(TEDIA，色譜純)，甲醇(TEDIA，色譜純)，甲酸(TEDIA，色譜純)。

1.2 儀器HPLC-UltiMate 3000&MS (Thermo Fisher Scientific，美國)，TSQ Quantum Access MAX(Thermo Fisher Scientific，美國)，Mili-Q超純水機(Thermo Fisher Scientific，美國)，移液器(Eppendorf，德國)，CT15RE臺式微量高速離心機(日立工機，日本)，DZF-6050型真空干燥箱(上海恒科技有限公司)，PH510 Series酸度計(吉爾森公司)，AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，XW-80A旋渦混合器(上海精科實業有限公司)，Multi-Tube Vortexer(北京踏錦科技有限公司)。

1.3 動物SPF級健康成年SD大鼠22只，雌雄各半，體質量(200±15)g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2013-0002。動物在中山大學東校園實驗動物中心SPF標準動物房中飼養，每日自由攝取去離子水和標準飼料。實驗程序經中山大學東校園實驗動物中心倫理委員會批準，符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

1.4 方法

1.4.1IBD大鼠模型的建立與評價

1.4.1.1 模型建立 取16只大鼠分別作為IBD造模組與空白對照組，雌雄各半。采用三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)造模法，按照體積比2 ∶1的比例混合5%TNBS水溶液與無水乙醇得TNBS灌腸溶液，對照組以生理鹽水代替5%TNBS水溶液。大鼠禁食24 h后，按0.3 mL·100g-1劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，隨后使用灌胃針經大鼠肛門插入8 cm達結腸部位，按照0.5 mL·100g-1劑量快速灌入灌腸液，倒提大鼠30 s后待大鼠自然清醒常規飼養。

1.4.1.2 評價指標 造模期間，每天觀察和記錄IBD組和對照組大鼠進食、毛色、活動情況、稱量和記錄大鼠體質量、記錄評價大便性狀。肉眼觀察大便隱血情況，進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分[6]。造模結束后，取出距肛門10 cm的結腸組織，沿腸系膜縱行切開，用冰冷生理鹽水沖洗，將黏膜向上展開，觀察豁膜損傷，進行結腸黏膜的大體損傷評分[7]。采用10%甲醛固定結腸組織，常規石蠟包埋后切片，通過光鏡下HE染色觀察大鼠腸道黏膜改變并評分[8]，平均觀察3個100倍視野，取平均值。

1.4.2IBD大鼠藥動學研究

1.4.2.1 供試品配制 精密稱取沙利度胺粉末適量，加入1%二甲基亞砜的生理鹽水渦旋混勻，得濃度2 g·L-1的沙利度胺混懸液，置于4 ℃冰箱保存，用于口服給藥。

1.4.2.2 動物分組與樣本采集 另取6只健康SD大鼠作為健康大鼠沙利度胺口服組用于藥動學研究，雌雄各半，同時對IBD模型組大鼠于造模6天后灌胃口服給予沙利度胺。根據沙利度胺用于IBD患者維持緩解的臨床劑量(50～300 mg·d-1)[5,9]，通過人與大鼠體表面積換算[10]，最終設置大鼠給藥劑量為10 mg·kg-1。于給藥前(空白血樣)及給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和48 h經眼眶后靜脈叢取血約0.3 mL，置于1.5 mL的肝素化EP管中。全血經4 500 r·min-1，4 ℃離心10 min分離得到血漿樣品，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.4.2.3 儲備液與工作液配制 分別精密稱取兩份沙利度胺標準品10 mg，溶解于1 mL體積比為50 ∶49 ∶1的甲醇 ∶乙腈 ∶甲酸溶液中，轉移至10 mL容量瓶，并用體積比為50 ∶49 ∶1的甲醇：乙腈：甲酸溶液定容到刻度，搖勻得1 g·L-1的標準儲備液，置于-20 ℃冰箱保存。兩份儲備液分別經50 ∶49 ∶1的甲醇：乙腈：甲酸溶液梯度稀釋，分別得到濃度20、50、100、500、1 000、5 000、10 000、20 000 μg·L-1的標準曲線工作液與濃度為50、1 000、16 000 μg·L-1的質控工作液，置于4 ℃冰箱保存。內標物7-羥基香豆素儲備液與工作液按照同樣方法配制最終得1 mg·L-1的標準工作液，置于冰箱4 ℃保存。

1.4.2.4 已知濃度樣本制備與樣本前處理 取大鼠空白血漿90 μL，置于1.5 mL離心管中，加入工作液10 μL，渦旋30 s混勻，配制成沙利度胺血漿濃度為2、5、10、50、100、500、1 000、2 000 μg·L-1的標準曲線血漿樣本和濃度為5、100、1600 μg·L-1的質控樣本。取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL的離心管中；加入的檸檬酸鈉緩沖液100 μL(pH=1.5)；加入內標工作液10 μL，旋渦10 s混勻；加入500 μL乙酸乙酯，旋渦振蕩1 min，靜置3 min，15 000 r·min-1，4 ℃離心5 min；吸上清液400 μL于另一干凈的1.5 mL離心管中，于真空干燥器中揮干約1 h；殘渣用流動相200 μL復溶，旋渦混合1 min，15 000 r·min-1離心5 min；取上清140 μL加入進樣瓶，采用經過方法學驗證的檢測方法[11]上樣20 μL分析。

1.4.2.5 色譜條件 色譜柱為BETASIL C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇：0.1%甲酸水溶液(70 ∶30，V/V)，以0.5 mL·min-1等度洗脫，柱溫為25 ℃，自動進樣器溫度為4 ℃，進樣盤溫度為10 ℃。

1.4.2.6 質譜條件 質譜離子源為大氣壓力化學電離源，離子化模式為正離子模式，噴霧電壓4 500 V，渦旋離子噴霧溫度280 ℃，毛細管溫度300 ℃，鞘氣(N2)壓力10 psi，輔助氣(N2)壓力8 psi，碰撞池氣體(N2)壓力1.5 mTorr。檢測模式為多反應監測，沙利度胺m/z259.1→186.1，碰撞能24 eV；7-羥基香豆素m/z163.1→107.1，碰撞能22 eV。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況與DAI評分對照組大鼠精神好，毛發平順，活動正常；體質量穩定增長；大便性狀正常，大便成形，呈顆粒狀，無便血；存活率100%。

IBD組大鼠在造模1 d后個別出現毛發變黃、豎毛等狀況，伴有精神怠慢，懶動弓背情況，出現稀便及肉眼血便；造模3 d后部分大鼠明顯消瘦，毛發干燥豎起，大便成形，多伴有黏液和膿液與少量隱血；造模5 d后3號雄鼠死亡，存活率87.5%。IBD組2號雄鼠和6號雌鼠外觀及活動情況正常，表現與對照組一致，其他大鼠在造模期間體質量呈明顯下降趨勢，結果見Fig 1與Tab 1。

結合大鼠的體質量和糞便性狀，進行疾病活動指數(DAI)評分，由于IBD組的2號和6號大鼠的一般狀況與空白組相同，考慮造模失敗，未將其進行評分。評分結果如Fig 2所示，造模期間IBD組大鼠的DAI評分明顯升高，造模后3 d評分迅速增高超過2分，且維持在較高水平，d 4評分開始下降，但仍然顯示有IBD癥狀，并且連續5 d維持在1分左右。

Fig 1 The body weight of rats in IBD group

*P<0.05,**P<0.01vsControl group.

Fig 2 The disease activity index of rats in various groups

Tab 1 The observation records of rat behavior and body hair

2.2 大鼠標本形態與組織評分肉眼觀察，對照組大鼠的結腸顏色粉紅，褶皺清晰，結腸細長；除2號和6號大鼠外，IBD組部分大鼠結腸出現潰瘍、充血、水腫以及腸壁增厚，重者可見壞死，結腸長度較粗，且長度明顯低于對照組。HE染色結果顯示，對照組大鼠的腸組織正常，結構完整(Fig 3A)。IBD組大鼠出現炎癥細胞浸潤、黏膜層糜爛、潰瘍、腺體排列紊亂等情況(Fig 3B)。組織病理學評分見Tab 2。

Fig 3 Colon tissues on day 7(×100)A：Control group；B：IBD group

Tab 2 Score of colonic macroscopic morphous and histopathology of rats in various

2.3 大鼠血藥濃度與藥代動力學參數采用UPLC-MS/MS測定血漿沙利度胺濃度，代表性色譜圖如Fig 4所示，藥時曲線如Fig 5所示，其藥代動力學參數見Tab 3。與健康大鼠相比，IBD組大鼠Cmax(3 767.8±2 259.1vs1 148.2±337.3(μg·L-1)，P<0.05)、AUC0-t(14 326.2±4 038.1vs6 002.8±2510.6(μg·h·L-1)，P<0.01)、AUC0-∞(14 375.6±4021.7vs6 064.2±2 549.5(μg·h·L-1)，P<0.01)均升高了2～3倍，而T1/2、Tmax、MRT等參數無明顯差異。

Fig 4 Chromatogram of thalidomide and 7-HydroxycoumarinA：Blank sample；B：LLOQ sample；C：Pharmacokinetic plasma sample；Ⅰ：thalidomide；Ⅱ：7-Hydroxycoumarin

Fig 5 Plasma concentration-time profiles of thalidomide after administration of 10 mg·kg-1 in

Tab 3 The pharmacokinetic parameters of thalidomide in plasma of

3 討論

疾病可使機體生理狀態發生一系列的變化，進而影響藥動學特征，使藥物效應出現增強或減弱，甚至發生藥物不良反應。本研究通過TNBS法構建得到了與臨床IBD病癥相似的IBD大鼠模型，考察了IBD對沙利度胺口服吸收的影響，結果顯示IBD大鼠口服沙利度胺的生物利用度增加了2.36倍，提示IBD疾病因素可促進大鼠口服沙利度胺的吸收。

目前IBD缺乏有效的根治方法，世界衛生組織將其列作現代難治病之一[12]。實驗動物模型的建立對研究IBD的發病機制、防治手段及藥物篩選等至關重要。TNBS合用乙醇是常用于IBD造模的方法，相較于乙酸誘導法、惡唑酮誘導法、角叉菜膠誘導法等方法，該方法操作簡單，成本較小，重復性好，維持時間久，且所構建的模型與人類IBD病癥相類似[13]。本研究采用TNBS法建立大鼠IBD疾病模型，并通過觀察大鼠狀態與量表評分以評價疾病模型，發現造模成功率為62.5%，且表現出了與臨床IBD相似的癥狀，提示造模較為成功，可用于后續研究。

藥物吸收的過程受到許多因素的影響，包括藥物性質、晶型、劑型和給藥途徑等[14]，機體本身生理病理狀態也會對藥物的吸收產生影響。對于口服藥物，消化系統疾病將影響藥物從消化道的吸收，如克羅恩病可減慢維生素D的吸收[15]。IBD作為一類炎癥性消化系統疾病，疾病發展過程中與免疫系統與腸道微生物群的相互作用密切相關[16]。研究表明，炎癥狀態下常伴有藥物代謝酶與轉運體表達與活性的改變，從而影響外源性物質的代謝與轉運，最終對血藥濃度產生影響[17-18]；此外由于IBD導致的胃腸道動力學、胃腸道pH、黏膜通透性、血流分布等的改變也可能對藥物的吸收產生影響。

本研究結果顯示，IBD狀態下大鼠口服沙利度胺的吸收顯著增加，這可能為臨床口服沙利度胺用于IBD治療提出新的考量，雖然有研究發現克羅恩病患者口服沙利度胺的吸收程度與速度相較健康人無明顯差異[11]，但該研究采血點稀疏，因此這一結論仍有待于臨床更大樣本量數據的支持。由于IBD發病機制復雜，這一結果可能是藥物代謝酶、轉運體與胃腸道生理因素變化共同作用的結果，其確切的機制仍需進一步研究。