中藥調控小膠質細胞改善阿爾茨海默病的研究進展

潘予璠，信琪琪，袁 蓉，繆 宇，叢偉紅

(1.天津中醫藥大學研究生院，天津 301617；2.中國中醫科學院西苑醫院心血管病實驗室，國家中醫心血管病臨床醫學研究中心，北京 100091)

小膠質細胞(microglia，MG)是中樞神經系統(central nervous system，CNS)的主要免疫細胞，約占CNS細胞的0.10～0.15。作為神經炎癥調控機制的主要參與者，MG以3種不同表型存在并發揮作用，即靜息狀態M0型和活化狀態M1、M2型。靜息狀態下，MG動態監測腦內微環境，清除細胞碎片和感染物質，形態上表現為“分枝形”，胞體較小，突起變長；當腦組織受到感染或損傷時，MG被激活為M1和M2兩種表型：M1型為促炎癥表型，在疾病過程中誘發多種炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等，誘導神經元損傷和氧化應激，進而引發突觸丟失，加速疾病進程；M2型為抗炎癥表型，通過產生抗炎因子和神經保護因子，如白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等，增強MG對淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的吞噬作用，抑制炎癥，改善疾病狀態[1]。綜合已有研究發現，MG過度激活可能促進神經炎癥、加速神經元損傷。中藥可改善AD腦內Aβ沉積，減輕神經炎癥，并通過調節MG表面受體表達促進其發揮M2型保護作用，從而改善大腦認知功能，起到預防和延緩AD的作用。本文對相關內容及中藥通過MG發揮改善AD的可能作用和機制進行總結和分析，以期為中藥治療神經退行性疾病提供理論依據。

1 MG在AD病變中的可能作用和機制

在AD病變中，MG以兩種激活狀態同時存在并發揮作用。伴隨衰老和受遺傳等因素的影響，M1型的比例不斷上升，可誘發釋放神經炎癥因子、加速微管相關蛋白(microtubule-associated protein，TAU)蛋白過磷酸化并增加突觸的丟失和膽堿系統功能障礙。MG在AD病變中的可能作用和機制，見Fig 1。

1.1 雙向調節Aβ沉積淀粉樣蛋白學說目前仍是AD發病機制的主流學說。該學說認為，Aβ聚集、沉積產生的神經毒性是最終導致認知功能障礙的主要形式。有研究提示在疾病不同階段，MG對Aβ沉積表現出雙向調節作用[2]。一方面，MG大量聚集在Aβ斑塊周圍形成屏障，抑制斑塊體積增加并保護神經元。另一方面，在Aβ的長期刺激下，激活的MG表現出有害作用，其釋放的炎癥介質(如炎性因子、補體成分和自由基等)參與AD發病，反過來加速Aβ的產生和積累，誘導神經炎癥和氧化應激等病理現象。研究表明，髓系細胞觸發受體2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)可能參與MG活化，進而發揮雙向調節Aβ沉積的機制。TREM2是MG表面的跨膜受體蛋白。TREM2釋放可溶性sTREM2，通過激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路促進MG增殖發生的同時，增強免疫應答反應和吞噬Aβ斑塊的作用[3]。

1.2 促進慢性神經炎癥神經炎癥被認為是AD三大發病機制(Aβ沉積、TAU蛋白過度磷酸化和神經炎癥)之一。大腦中的炎癥是由激活的MG和星形膠質細胞誘發的，其中MG被認為是介導炎性反應的關鍵因素。研究表明，MG能夠被多種物質活化并激活其下游信號通路核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等，進而產生神經毒性細胞因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6和活性氧自由基等)，導致Aβ清除受阻、TAU病理加重以及突觸丟失等病理現象[4]。

Fig 1 Role and possible mechanisms of microglia in pathological changes of AD

補體是一組存在于人和動物細胞表面的蛋白，經活化后具有生物活性，可介導免疫和炎癥反應，也稱為補體系統。研究表明，MG是大腦補體C1q(complement C1q)蛋白的主要來源，而后者的上調將作為經典補體系統的啟動信號，靶向神經炎癥因子的產生和神經元丟失，抑制C1q活動可以挽救神經炎癥誘導的認知功能障礙[2]。經典補體系統釋放炎癥信號誘導M1型細胞活化，釋放IL-1β、IL-6等炎癥因子引發慢性神經炎癥反應[5]。因此，抑制MG激活或使用抗炎藥物成為治療AD神經炎癥的一種潛在方式，但其療效和長期服用可能導致的副作用尚無統一結論。具有抗炎作用的傳統中藥種類繁多，相較長期服用西藥治療，中藥具有療效顯著、副作用小的特點，有潛在開發價值。

1.3 加速TAU蛋白過磷酸化TAU蛋白是CNS中含量最高的微管相關蛋白。Fuyuki等[6]于2018年提出TAU誘導的突觸功能障礙早于Aβ病理的產生，且突觸丟失與認知能力下降具有極強的相關性，故推測TAU蛋白而非Aβ可能是影響AD進展的主要因素。

MG在TAU病理的啟動和傳播中發揮重要作用。研究表明，TREM2和APOE過表達調節MG釋放多種炎性因子(如IL-6、TNF-α和IL-1β等)以及補體C1q蛋白，誘發神經炎癥和經典的補體級聯反應，加速病理性TAU蛋白聚集和突觸丟失。另外，MG可通過吞噬細胞和體外分泌囊泡的方式參與介導病理性TAU蛋白的傳播，減少MG數量可以顯著抑制病理性TAU蛋白的產生和傳播過程[7]。但是，MG如何啟動和介導TAU的病理過程，目前尚不明確。

1.4 誘導膽堿能系統功能障礙在AD病變過程中，乙酰膽堿酯酶與Aβ相互作用，促進淀粉樣斑塊的形成和MG活化，Yulia等[8]采用腦室注射免疫毒素192IgG-saporin誘導膽堿能細胞死亡，構建膽堿能神經元變性模型，研究發現注射1.5月后大鼠海馬CA3區和DG區離子鈣結合適配器分子 1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)陽性細胞數量顯著增加，更多MG呈現“胞體增大、突起回縮”的活化狀態，并伴隨神經元的丟失。毒蕈堿型受體、煙堿型受體是存在于MG表面的兩類膽堿能受體。APP/PS1小鼠終生補充5.0 g·kg-1氯化膽堿飲食后，其水迷宮實驗結果獲得改善、MG誘導的炎癥得到緩解，相關機制可能與抑制MG活化以及煙堿樣乙酰膽堿受體α7亞型(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nACh)等煙堿型受體的表達下調有關[9]。

2 中藥提取物及有效成分對AD小膠質細胞的調節作用

中藥有多成分、多靶點、多途徑的治療特點，對于發病機制復雜的疾病表現出較好的療效和較低的毒副作用。西醫對AD一直缺乏有效治療手段，而近年來中醫藥防治AD的研究引起廣泛關注，為患者帶來新的希望。有學者指出，MG作為神經炎癥的主要參與者，其不同表型變化伴隨疾病的發展表現出對AD的雙向調節作用，Aβ激活的MG通常表現為神經毒性細胞因子產生、早期突觸丟失和記憶功能損傷。另外，隨著年齡的增長，慢性炎癥也會損害MG的防御功能并引發促炎癥型MG活化，而MG的激活與其穩態基因的下調和AD風險基因的上調有關，包括APOE、TREM2和TYRO蛋白酪氨酸激酶結合蛋白(transmembrane immune signaling adaptor，TYROBP)，其中TREM2被證明參與MG的激活過程，該蛋白功能的改變可能對AD中MG的活化和不同表型之間的轉化發揮重要作用[10]。因此，依據MG的作用機制可將中藥的干預途徑總結為以下3種：通過抑制MG促炎癥表型增強對Aβ的吞噬作用，限制MG激活的有害影響；通過增加M2型抗炎特性減少腦內神經炎癥，增強MG神經保護作用；通過調節多種受體蛋白表達干預MG的免疫反應。

2.1 抑制MG激活，增強神經保護作用有研究指出，Aβ毒性蛋白沉積與MG不同表型的激活關系密切。隨著Aβ沉積增多，MG吞噬和清除作用增強。但在衰老和遺傳等因素影響下，過量的Aβ沉積將激活MG進入炎癥狀態，即M1表型，在這種狀態下，MG吞噬突觸神經、分泌炎性細胞因子并促進TAU病理變化的擴散，大大加速疾病的發展過程[2]。

苦參堿是一種喹諾里西啶類生物堿，是中藥苦參的主要活性成分之一，Li等[11]通過側腦室注射低聚Aβ蛋白(2.5 g·L-1，4 μL)建立認知障礙和神經炎癥模型小鼠，腹腔注射不同濃度苦參堿溶液(10、20和40 mg·kg-1)21 d后發現，MG活化程度顯著較低，海馬組織中ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達水平均下降，且兩種還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶亞型的表達下調。化療引起的認知障礙是化療期間常見的副反應，患病率高達0.69～0.78。有研究表明，10 mg·kg-1人參皂苷RG1給藥3周，可以顯著提高腹腔注射DAC(多西他賽、阿霉素、環磷酰胺)引起的化療腦模型小鼠水迷宮游泳成績，降低海馬神經元活性，減少促炎因子表達，提示人參皂苷RG1可以通過調節MG活化介導的細胞因子發揮神經保護和改善認知的作用[12]。此外，大豆中的異黃酮類成分可通過抑制MG激活及其激活后產生和釋放的可溶性促炎因子而發揮神經保護作用[13]。白藜蘆醇是廣泛存在于多種植物中的一種非黃酮類多酚化合物，由于其具有顯著的神經保護、免疫調節等作用，成為近年來AD研究的熱點。李曉光[14]用FAM熒光標記Aβ蛋白，通過檢測含有FAM-Aβ熒光的BV-2細胞數量來顯示細胞的吞噬作用，結果表明，20 μmol·L-1白藜蘆醇可顯著提高BV-2細胞對Aβ的吞噬作用，給藥組TREM2蛋白表達量是對照組的1.7倍，血清中sTREM2含量相比對照組降低0.7，且吞噬作用隨外源性sTREM2的增加而增強，推測白藜蘆醇通過促進TREM2蛋白表達及抑制sTREM2，進一步影響BV-2細胞對Aβ的吞噬功能。

另有研究表明，姜黃素可以有效抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的BV-2細胞炎癥因子釋放，降低M1型細胞比例，并增強細胞吞噬作用，推測姜黃素可能通過靶向TREM2-TLR4介導的NF-κB信號通路抑制MG活化、發揮吞噬和抗炎作用[5]。Gao等[15]利用TLR4-/-基因敲除小鼠探究中藥姜黃素調控TLR4/NF-κB信號通路調節MG的作用機制，結果表明腹腔注射50、100和200 mg·kg-1姜黃素24 h可顯著抑制TLR4、NF-κB和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)等蛋白表達。其中，姜黃素100 mg·kg-1可顯著抑制促炎因子釋放和MG激活。

2.2 促進M2型活化，減少腦內炎癥神經炎癥是CNS在感染、毒性代謝物、創傷或自身免疫的刺激下發生的一種免疫失調。為了應對CNS損傷、保護腦功能，小膠質細胞、巨噬細胞和星形膠質細胞等免疫細胞會調控突觸平衡并促進凋亡細胞的清除。在神經退行性疾病中，上述過程可能會受到影響。代替激活型MG(M2極化)是MG的一種具有神經保護和神經炎癥抑制作用的活化表型，通常存在于疾病的急性損傷期，具有促進組織修復和再生、保護神經元并釋放IL-4和IL-10等抗炎細胞因子、抑制炎癥反應的作用。可見，在不同病理時期，MG激活后將發揮不同的作用，因此，如何促進MG向M2表型活化并發揮神經保護作用被認為是治療和改善AD的關鍵。

補虛藥是治療AD時使用頻率最高的一類中藥，其中淫羊藿的有效成分淫羊藿苷已被證明是一種有效的抗炎劑。以炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)標記M1型細胞、以抗炎因子(IL-4、IL-10和TGF-1)標記M2型細胞，探究淫羊藿苷調節MG極化的作用機制發現，淫羊藿苷可顯著提高APP/PS1雙轉基因小鼠水迷宮游泳成績、抑制M1型標記物的表達，其機制可能是通過激活PPARγ受體蛋白通路從而誘導M1向M2極化[16]。另外，轉錄調節因子NF-κB也是中藥調控MG激活、表型轉化和神經炎癥的重要信號分子。研究表明，西紅花的主要成分西紅花苷可顯著抑制LPS誘導的BV-2細胞炎性因子和活性氧物質的產生，其機制可能是通過抑制NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)和NF-κB信號通路、促進MG向M2型極化進而發揮抗炎作用[17]。以脂多糖誘導的BV-2細胞模型研究丹參酮I干預神經炎癥細胞因子表達發現，丹參酮I可顯著降低NO、TNF-α和IL-6的生成、抑制NF-κB信號通路，發揮神經保護作用，并顯示出劑量依賴性。隨后采用C57BL/6小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 -四氫吡啶的方法建立帕金森病模型，再次證實了這一結論[18]。黃柏的甲醇提取物在干預AD引發的炎癥時也表現出相同的作用機制，MG中炎性因子TNF-α和IL-1β的表達被高度抑制，同時NO誘導的神經元死亡減少[19]。銀杏葉提取物EGb 761被證明具有抗炎作用，其機制可能是通過降低前列腺素E2的釋放而抑制MG活化和細胞因子的釋放[20]。此外，β-細辛酮[21]、川芎嗪[22]和延胡索[23]等成分也被證明具有調節MG極化、降低炎性因子表達，從而改善神經炎癥的作用。

2.3 調節MG受體蛋白表達人類基因組測序結果提示，MG中多種免疫相關受體的基因在AD中呈高表達(如TREM2、CR1和CD33等)，且其蛋白產物通常作為膜受體參與呈遞抗原、吞噬有害物質以及調節炎癥反應等免疫功能。地黃所含成分梓醇可抑制LPS誘導的TLR4和MyD88的蛋白表達，減少細胞表面TLR4和LPS的結合，進而抑制NF-κB信號通路的活化發揮抗炎和神經保護作用[24]。黃芪甲苷是中草藥黃芪的主要活性成分，給藥14 d后可顯著改善大鼠腦損傷所致的中樞神經炎癥，增加PPARγ受體蛋白表達和神經保護因子的釋放[25]。

除中藥有效成分外，中藥復方調控MG研究也有進展。新近結果提示，灌胃給予3×Tg-AD轉基因小鼠芍藥甘草湯36 d，可顯著提高其水迷宮成績，降低小鼠海馬區和大腦皮層內炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，抑制腦內Aβ聚集和TAU蛋白過磷酸化，通過下調NLRP1/NLRP3蛋白表達發揮抗Aβ聚集和神經保護作用[26]。王蕾等采用腹腔注射百日咳毒素和皮下注射隧橋少突膠質細胞糖蛋白建立C57BL/6J小鼠炎癥模型，灌胃給予補腎益髓膠囊(3.02 g·kg-1)，結果顯示小鼠體質量增加、炎癥減輕，其中M1型小膠質細胞數量(iNOS+/Iba1+)降低，M2型小膠質細胞數量(Arg1+/Iba1+)升高，炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達水平均顯著降低，其機制可能與下調miR-124表達、上調miR-155表達、促進M2型細胞極化有關[27]。目前已知的中藥調控小膠質細胞的作用機制參見Tab 1。

3 展望

據國際阿爾茨海默病協會2018年報告，全球每3 s就會有1例癡呆患者產生，預計到2050年，全球將會有1.51億人患有癡呆，其中2/3為AD患者[28]。現有的AD治療藥物均無法抑制AD的發生或發展進程，包括適用于任何階段的膽堿酯酶抑制劑和用于中度或重度患者的鹽酸美金剛片。因此，有學者提出，以多種藥物聯合療法作為治療阿爾茨海默病的未來方案。可見，針對發病機制復雜、病理現象相互影響的多因素疾病，其治療必須從單一靶點藥物轉向多靶點的藥物，中藥因其自身特性可作為神經退行性疾病的潛在藥物。另外，藥物能夠被吸收并通過血腦屏障進入中樞神經系統也是AD藥物開發時需要考慮的關鍵因素，對此中藥提供了豐富的備選資源[23]。

“雙刃劍”效應使得以MG為靶點的治療復雜化。在疾病早期，激活MG有助于Aβ吞噬作用和神經保護；而在疾病后期，抑制M1型活化對于減緩疾病進程至關重要。Aβ吞噬作用是MG作為中樞神經免疫細胞具有的特殊功能，在AD疾病進程中發揮重要作用。但目前關于MG對Aβ的吞噬作用研究較少。已知通過FAM、methoxy-X04免疫熒光染色可有效檢測吞噬性MG數量，酶聯免疫吸附法可檢測血清中Aβ積累[29]，或可為中藥調控MG吞噬作用研究提供有效檢測方法。盡管大量研究已證實，中藥有效成分或復方對調控MG、改善AD表現出較好的潛在治療作用，但存在體內研究較少、檢測手段單一、作用機制不明確等問題。因此，未來的研究一方面應充分關注中藥在疾病不同階段的多靶點作用以及對MG表型轉化的影響；另一方面應深入探究MG在神經炎癥、氧化應激、能量代謝等方面的作用機制以及中藥的相關調控途徑，從而為中藥或復方靶向調控MG、改善AD提供新的思路。

Tab 1 Regulative mechanisms of traditional Chinese medicine on microglia