高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中15種禁限獸藥殘留

李 寧，肖 琎，王雪松，苑中策，董潔瓊，王圓圓，鄭百芹，李明陽(yáng)，雷舒涵，龐學(xué)良，吳 桐

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北唐山 063000；2.遵化市畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，河北遵化 064200；3.唐山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北唐山 063000）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展，肉類食品消費(fèi)量不斷增長(zhǎng)，質(zhì)量安全問題也日益凸顯（劉柏林等，2021）。農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中明確規(guī)定禁止用于所有食品動(dòng)物和不得在動(dòng)物性食品中檢出的藥物有三十余種（王鶴佳等，2021；楊麗君等，2015）。這些藥物殘留在動(dòng)物性食品中會(huì)成嚴(yán)重危害人體健康（方從容等，2018）。目前，禁限獸藥殘留的檢測(cè)方法大多是針對(duì)某種或者某類獸藥，因此，建立一種同時(shí)檢測(cè)多類違禁藥物的方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義（程曉宏等，2022；韓瑨烜等，2022；懷文輝等，2018）。

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以豬、雞、牛、羊肉基質(zhì)為樣本，β-受體激動(dòng)劑類、硝基咪唑類等15種禁限獸藥殘留為待測(cè)組分，對(duì)前處理?xiàng)l件、液相色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種多種類禁限獸藥同時(shí)檢測(cè)的方法，以期為動(dòng)物源性食品中禁限獸藥分析和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供數(shù)據(jù)支撐（朱姍姍等，2020）。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀、5500+三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜儀（美國(guó)AB）；渦旋混勻儀（IKA）；氮?dú)獍l(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

甲硝唑等15種標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈（Dikma）；SCRS凈化柱、萃取鹽包（Cyan科技公司）；五氟苯基色譜柱（美國(guó) Phenomenex）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液（10μg/mL）配制：分別將甲硝唑等15種標(biāo)準(zhǔn)品（濃度均為100μg/mL）用甲醇稀釋定容，-20℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液（100 ng/mL）配制：準(zhǔn)確移取甲硝唑等15種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液各100μL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，4℃避光保存。

用 工 作 液 配 制 濃 度 范 圍 為 0.5、2、5、20、50 ng/mL系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理 樣品前處理：準(zhǔn)確稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管1（含三顆鋯珠）中；加入 2 mL純凈水，震蕩渦旋 30 s；加入 1% 乙酸-乙腈溶液10 mL，震蕩渦旋5 min；超聲提取15 min，8000 r/min 離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管2中；重復(fù)提取一次，將提取液合并至離心管2中，并加入萃取鹽包，立即震蕩渦旋30 s，8000 r/min 離心 5 min，SCRS 凈化柱凈化，取 5 mL凈化液氮吹至近干，用 1 mL甲醇 -水（1：1）復(fù)溶，過0.22μm微孔濾膜，供儀器分析測(cè)定。

1.4 HPLC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：五氟苯基色譜柱100A（2.6μm，100×2.1 mm）；柱 溫 ：40 ℃ ；進(jìn)樣體積：2μL；流速為0.4 mL/min，流動(dòng)相：溶劑A為0.1%甲酸-水；溶劑B為乙腈，梯度洗 脫 程 序 ：0 ～ 0.5 min，1%B ；0.5 ～ 0.6 min，10%B ；0.6 ～ 8 min，100%B ；8.0 ～ 10 min，1%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI+模式；電噴霧電壓5500 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣：35 psi；輔助氣 1：55 psi；輔助氣 2：55 psi；多反應(yīng) MRM掃描。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化 在5 ng/kg添加水平下，15種禁限獸藥用乙酸乙酯、乙腈、甲醇、1%（V/V）乙酸-乙腈溶劑提取，目標(biāo)組分最低回收率分別為45%、67%、58%、77%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)渦旋震蕩后再經(jīng)超聲助提可明顯提高提取效率。與渦旋震蕩10 min相比，渦旋震蕩5 min加標(biāo)回收率無(wú)差異。超聲10、15、20 min的最低回收率分別為68%、77%、78%。若提取一次，加標(biāo)回收率范圍為44%～82%，重復(fù)提取為77%～104%。比較了無(wú)水NaSO4和無(wú)水MgSO4為主要成分的萃取鹽包，采用 2 g無(wú)水 NaSO4和 1 g無(wú)水 MgSO4混合萃取鹽包除水效果較好。還比較了Prime HLB、SCRS凈化柱兩種固相萃取柱的凈化效果，加標(biāo)回收率范圍分別為55%～96%、77%～104%。

2.2 基質(zhì)效應(yīng) 為了降低基質(zhì)效應(yīng)，評(píng)價(jià)了在4種不同基質(zhì)中，15種禁限獸藥的響應(yīng)值，以樣品前處理的空白基質(zhì)和50%乙腈-水分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以二者的斜率計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種基質(zhì)中15種禁限獸藥的ME值在0.851～1.079之間，說明SCRS凈化柱凈化效果顯著。

2.3 液相色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化 為了減少上機(jī)溶劑效應(yīng)的干擾，采用乙腈為有機(jī)相。比較了水、0.1%甲酸-水作為水相，表明0.1%甲酸-水作為水相各組分的響應(yīng)值較好，峰形呈現(xiàn)較好。另比較 Waters T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）、五 氟 苯 基 色 譜 柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）響應(yīng)值及色譜峰形，表明五氟苯基色譜柱比T3色譜柱響應(yīng)值高13%。將15種禁限獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配置成濃度為2 ng/mL，采用MRM模式，以ESI+模式優(yōu)化各個(gè)離子對(duì)的去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 線性關(guān)系及檢出限、定量限 由表2可知，將15種禁限獸藥標(biāo)準(zhǔn)工作液用50%乙腈-水作為溶劑，配制濃度范圍為 0.5、2、5、20、50μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15種禁限獸藥在0.5～50μg/L的范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。以3倍基線噪聲確定各組分的檢出限，10倍基線噪聲確定各組分的定量限，最低檢出限均低于0.5μg/kg，定量限均低于1.0μg/kg。表明該方法具有較好的靈敏度。

表2 15種禁限獸藥的線性方程、檢出限和定量限

2.5 加標(biāo)回收率和精密度 由表3可知，在4種空白基質(zhì)樣品中添加5μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果表明，4種基質(zhì)樣品中15種禁限獸藥的平均加標(biāo)回收率為78%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為2.6%～8.3%。

表3 豬、雞、牛、羊肉樣品中15種禁限獸藥的回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品分析 采用該方法對(duì)隨機(jī)采取的4種基質(zhì)30份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中雞肉樣品中檢出1份甲硝唑藥物殘留，其定量結(jié)果為2.3μg/kg。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 1626-2019）進(jìn)行復(fù)驗(yàn)，定量結(jié)果為2.0μg/kg，結(jié)果偏差為13%，說明禁限獸藥在動(dòng)物源性食品中依然存在添加風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本文建立了4種基質(zhì)中檢測(cè)15種禁限獸藥殘留的檢測(cè)方法，采用外標(biāo)法定量。該方法具有操作簡(jiǎn)單、回收率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可適用于大批量樣本分析，為風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供有效的數(shù)據(jù)支撐。