MAGE-As蛋白及mRNA在肺癌中的表達水平變化及其臨床意義*

楊 晨，單長鳳

安徽理工大學第一附屬醫(yī)院病理科，安徽淮南 232007

全球肺癌發(fā)生率及病死率均位于惡性腫瘤的第1位，由于早期癥狀不具有典型性，肺癌的早期檢出率較低，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，喪失最佳手術(shù)時機，5年生存率僅為4.7%～29.7%[1-3]。因此，尋找一種有效的早期標志物對肺癌臨床治療方案制訂及預(yù)后預(yù)測具有重要價值。黑色素瘤抗原(MAGE)屬分化良好的癌/睪丸抗原(CTL)家族，包含MAGE-Ⅰ類抗原與MAGE-Ⅱ類抗原，臨床研究已證實，MAGE-A3在Ⅰ期、Ⅱ期的非小細胞肺癌中的表達率為39.2%,MAGE-A4的表達率為48.0%[4-5]，在肺鱗癌中的表達率為98.0%[6]，而MAGE-As為MAGE-A家族成員，關(guān)于其在肺癌中的表達水平仍缺乏研究。為進一步探討MAGE-As蛋白及mRNA在肺癌組織中的表達模式及其預(yù)后中的價值，本研究對91例肺癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織MAGE-As蛋白及mRNA進行檢測，并探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2018年7月至2020年12月于本院經(jīng)手術(shù)病理組織檢查證實的91例肺癌患者作為研究對象，其中男59例，女32例，年齡45～69歲，平均(57.62±3.28)歲；病理類型：52例腺癌，31例鱗癌，8例混合癌；腫瘤最大徑：<5 cm 57例，≥5 cm 34例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期49例，Ⅲ～Ⅳ期42例；分化程度：高分化39例，中分化35例，低分化17例；淋巴血管間隙浸潤37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；遠處轉(zhuǎn)移29例。本研究方案獲取本院醫(yī)學倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。納入標準：符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》中相關(guān)診斷標準[7]，且經(jīng)手術(shù)病理組織學檢查證實為肺癌排除標準：(1)術(shù)前有放化療及內(nèi)分泌治療史者；(3)合并肺心病、支氣管哮喘等其他肺部疾病者；(4)病變與鄰近結(jié)構(gòu)分界不清晰者；(5)存在嚴重聽力障礙、語言功能障礙或精神性疾病者。

1.2方法 選取手術(shù)切除的肺癌組織及距離癌組織邊緣>5 cm的相應(yīng)癌旁正常組織進行MAGE-As蛋白及mRNA檢測。(1)MAGE-As蛋白檢測：福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，脫水，染色，采用北京百奧萊博科技有限公司免疫組化SP法試劑盒檢測MAGE-As蛋白表達水平。陽性判定標準：高倍顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)或細胞核中存在棕黃色顆粒。按染色強度記為0分(無)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；按染色范圍記為0分(高倍鏡視野中陽性細胞數(shù)<5%)、1分(5%≤高倍鏡視野中陽性細胞數(shù)<25%)、2分(25%≤高倍鏡視野中陽性細胞數(shù)<50%)、3分(50%≤高倍鏡視野中陽性細胞數(shù)<75%)、4分(高倍鏡視野中陽性細胞數(shù)≥25%)。二者乘積≥3分定義為陽性；(2)MAGE-As mRNA檢測：采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司TRIzol試劑提取肺癌組織及癌旁組織中總RNA，以北京普析通用儀器有限責任公司TU-1810S型紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時熒光定量PCR擴增，擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，65 ℃ 45 s，72℃ 90 s，共31個循環(huán)，72 ℃ 6 min。瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳PCR產(chǎn)物。最后，以2-ΔΔCt公式計算MAGE-As mRNA相對表達量(單位為1)。第一輪PCR MAGE-1引物，F(xiàn)：5′-ACT GGC CCT GGC TGC AAC-3′；R：5′-GCC CTG ACC AGA GTC ATC AT-3′(擴增長度993 bp)；MAGE-1-1引物，F(xiàn)：5′-ACT GGC CTT GGC TGC AAC-3′；R：5′-CCC TGA CGA GAG TCA TCA TG-3′(擴增長度965 bp)。第二輪MAGE-2 PCR引物，F(xiàn)：5′-ACT GGC CCT GGC TGC AAC-3′；R:5′-AGG CCC TGG GCC TGG TG-3′(擴增長度914 bp)；MAGE-2-2引物，F(xiàn)：5′-ACT GGC CTT GGC TGC AAC-3′；R：5′-AGG CCC TGG GCT TGG TG-3′(擴增長度893 bp)。內(nèi)參GAPDH引物，F(xiàn):5′-ACC TGA CCT GCC GTC TAG AA-3′；R:5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。

2 結(jié) 果

2.1癌組織及癌旁正常組織MAGE-As蛋白陽性率及mRNA表達水平 肺癌組織MAGE-As蛋白陽性率及mRNA表達水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1～2。

表1 比較癌組織及癌旁正常組織MAGE-As蛋白及mRNA表達水平

圖1 MAGE-As蛋白在肺癌組織、癌旁正常組織中的表達免疫組化SP法圖

注：A為肺鱗癌的癌旁組織和腫瘤組織中MAGEA2的表達情況；B為肺腺癌的癌旁組織和腫瘤組織中MAGEA2的表達情況。圖2 MAGE-As mRNA在肺癌組織、癌旁正常組織中的表達

2.2不同臨床病理特征患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平 不同性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、病理類型、腫瘤最大徑的患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同臨床分期、分化程度、有無淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 比較不同臨床病理特征患者MAGE-As蛋白及mRNA表達水平

2.3MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與臨床病理特征相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(P<0.05)，與分化程度呈負相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與臨床病理特征相關(guān)性

2.4MAGE-As蛋白及mRNA表達水平與肺癌預(yù)后的關(guān)系 91例肺癌患者脫落5例，3年生存率66.30%(57/86)，以表1中MAGE-As蛋白及mRNA表達水平均值為界限，將患者分為MAGE-As蛋白陽性表達、陰性表達，MAGE-As mRNA高表達者(>2.86)、低表達者(≤2.86)，結(jié)果顯示，MAGE-As蛋白陽性表達、MAGE-As mRNA高表達者3年生存率低于MAGE-As蛋白陰性表達、MAGE-As mRNA低表達者(χ2=8.195、31.389，P<0.05)，見圖3～4。

圖3 MAGE-As蛋白與肺癌3年預(yù)后的關(guān)系

圖4 MAGE-As mRNA表達與肺癌3年預(yù)后的關(guān)系

2.5肺癌預(yù)后的影響因素 以3年肺癌預(yù)后為因變量(生存=0，死亡=1)，以年齡、臨床分期、分化程度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、MAGE-As蛋白及mRNA為自變量，應(yīng)用Cox多因素回歸方程分析，結(jié)果顯示，臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、MAGE-As蛋白及mRNA是肺癌預(yù)后的重要影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 肺癌預(yù)后的Cox多因素回歸分析

3 討 論

既往研究指出，選擇合適的靶抗原是腫瘤免疫治療開展的關(guān)鍵[8]。MAGE-As通過腫瘤特異性表達水平模式，可被CTL細胞識別，促使機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，故具有成為腫瘤免疫治療靶點的潛力[9-10]。LI等[11]通過收集115例乳腺癌組織顯示，MAGE-As共抗原肽特異性CTL與抗CTLA-4單克隆抗體和5DC聯(lián)合使用，具有有效腫瘤細胞殺傷作用，可為乳腺癌治療發(fā)展提供了新的理論。本研究中，MAGE-As蛋白在肺癌組織中呈高表達，而在癌旁正常組織中無表達，結(jié)合朱呈祥等[12]和李青等[13]研究考慮機制可能與腫瘤組織中表觀遺傳學調(diào)節(jié)過程紊亂有關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤中AMP依賴的蛋白激酶泛素化可能也是MAGE-As蛋白參與肺癌病理進程的重要機制。提示MAGE-As蛋白有望成為理想的腫瘤免疫治療靶點，并可作為腫瘤標志物檢測肺癌的發(fā)生。同時，越來越多文獻報道，MAGE基因在肺癌早期腫瘤形成、細胞增殖和侵襲調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[14-15]。本研究經(jīng)Spearman相關(guān)性表明，MAGE-As蛋白的表達與肺癌患者臨床病理特征有關(guān)，這可能歸因于MAGE-As可誘導(dǎo)腫瘤細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，繼而對腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生一定影響。因此推測MAGE-As蛋白的表達水平可能與肺癌惡性程度相關(guān)，但谷麗娜等[16]研究卻認為，肺腺癌組織中MAGE-As蛋白表達與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，與本研究觀點存在一定差異，可能與樣本量、肺癌類型不同有關(guān)。進一步經(jīng)Log-Rank檢驗發(fā)現(xiàn)，MAGE-As蛋白陽性表達可能降低肺癌3年生存率，推測MAGE-As蛋白可作為肺癌患者預(yù)后的有效預(yù)測指標。

另外，多項研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、疾病進展及預(yù)后評估中扮演著重要角色，但其具有異質(zhì)性、聚集成團等缺點，在循環(huán)血中含量較低[17-18]。而miRNA是一種非編碼小分子RNA，可在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白質(zhì)的生物合成，參與細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等進程，且miRNA分子穩(wěn)定，樣本獲取較為方便，適用于臨床實驗室檢測[19-20]。有研究表明，MAGE-As可能作為循環(huán)腫瘤細胞的標記，有效評估腫瘤負荷情況，對患者臨床轉(zhuǎn)歸具有重要預(yù)測價值[21]。本研究通過對比發(fā)現(xiàn)，肺癌組織MAGE-As mRNA表達水平高于癌旁正常組織，與高建全等[22]研究相似，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與分化程度呈負相關(guān)，這可能肺癌發(fā)生時，MAGE-As基因啟動子區(qū)出現(xiàn)異常去甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致MAGE-As表達水平明顯升高，增加基因不穩(wěn)定因素，提高腫瘤易感性，從而參與肺癌病理進程。由此可見，檢測MAGE-As mRNA表達對肺癌早期發(fā)現(xiàn)、惡性程度評估及臨床靶向治療均起到了一定指導(dǎo)價值。Cox多因素回歸分析進一步提示MAGE-As mRNA高表達水平是肺癌預(yù)后的獨立危險因素，說明MAGE-As mRNA低表達水平有助于指導(dǎo)肺癌患者獲得較好預(yù)后。

綜上所述，MAGE-As蛋白陽性表達及mRNA高表達水平可能與肺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可為臨床評估肺癌病理特征、促進預(yù)后改善提供指導(dǎo)。但本研究不足之處在于納入病例數(shù)較少，缺少在免疫治療時MAGE-As蛋白及mRNA表達情況是否可用于指導(dǎo)臨床實踐用藥研究，有待后續(xù)進行多中心、大樣本研究。