泛素C末端水解酶-L1的表達水平與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

丁 浩,徐 輝,龔晨虎,張志宏

蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院胸外科，江蘇蘇州 215600

肺癌是目前全球發(fā)病率居于首位的惡性腫瘤,也是導(dǎo)致患者癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-3]。由于生活方式與環(huán)境的改變，肺癌的總體發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為威脅人類健康的重大問題。非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌組織學(xué)類型，腫瘤生長速度快，腫瘤細胞容易從原發(fā)部位擴散并轉(zhuǎn)移至遠隔器官，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[4-5]。目前依然缺乏典型的分子標志物用于NSCLC患者的早期診斷與預(yù)后評估。因此，尋找新的分子標志對有效識別肺癌高危人群，深入了解NSCLC的生物學(xué)機制，對加快腫瘤的治療、研究意義重大。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細胞維持細胞正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要組成部分，其通過泛素連接酶與靶蛋白結(jié)合，參與蛋白的降解與功能修飾[6-7]。另一方面，泛素-蛋白酶體也可以通過去泛素化酶(DUBs)使從其靶點上分離[8]。與泛素連接酶類似，DUBs參與了細胞生長、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種細胞生物學(xué)進程，目前已在許多人類疾病中發(fā)現(xiàn)了DUBs的突變或表達水平失調(diào)[9-10]。泛素C末端水解酶-L1(UCH-L1)是去泛素化酶家族成員之一，研究表明它主要在腦組織中表達，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11-13]。盡管UCH-L1在其他組織中的表達水平較低，但在乳腺癌[14-15]、結(jié)直腸癌[16]、鼻咽癌[17-18]等癌癥中卻發(fā)現(xiàn)了UCH-L1的過表達，提示其可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。就生物學(xué)功能而言，有研究報道UCH-L1可能在腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及化療耐藥中發(fā)揮促癌作用[19-22]。然而，目前尚不清楚UCH-L1在NSCLC中的表達水平及其預(yù)后意義。本研究利用免疫組織化學(xué)染色檢測了UCH-L1基因在NSCLC組織中的表達情況，分析了其表達水平與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，旨在揭示UCH-L1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為潛在預(yù)后標志物的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2019年10月于本院胸外科接受根治性手術(shù)治療的112例NSCLC患者為研究對象，收集患者手術(shù)切除后的腫瘤組織與匹配的癌旁組織標本。納入標準：(1)所有患者均行肺葉或肺段切除+區(qū)域淋巴結(jié)清掃，經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)證實為原發(fā)性NSCLC；(2)術(shù)前未接受放、化療、靶向治療等任何抗腫瘤措施。排除標準：(1)術(shù)前影像學(xué)或穿刺活檢已證實有遠處轉(zhuǎn)移或鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、有其他器官共存腫瘤者；(2)臨床病理資料缺失或失訪者。本研究經(jīng)本院倫理審核委員會批準，組織樣本與臨床數(shù)據(jù)的使用在手術(shù)前均以書面形式獲得所有患者或其家屬的知情同意。

通過本院電子病例數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)收集所有研究對象的一般資料與臨床病理特征，包括：患者年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理學(xué)TNM分期等。肺癌TNM分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)制定的第8版分期手冊進行分類[23]。

1.2免疫組化染色與結(jié)果判讀 所有組織樣本在取材收集后立即置于福爾馬林緩沖液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制成3～5 μm厚度的組織切片。二甲苯中脫蠟、梯度乙醇脫水后，將組織切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH=7.4)中進行抗原修復(fù)；使用3%過氧化氫溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，5%胎牛血清降低非特異性結(jié)合，按照說明書以1∶100比例稀釋抗UCH-L1的小鼠單克隆抗體(產(chǎn)品編號：sc-100340，Santa技術(shù)公司，美國)，室溫下孵育一抗過夜。PBS緩沖液清洗切片3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗(產(chǎn)品編號：PV-9001，中杉金橋，中國)，于室溫下孵育30 min。最后，使用二氨基聯(lián)苯胺對免疫反應(yīng)進行可視化，蘇木素復(fù)染，依次經(jīng)過梯度乙醇進行脫水處理、二甲苯透明化，中性樹膠封片固定。

根據(jù)染色強度和陽性染色范圍對UCH-L1的表達水平進行半定量分析，具體方法如下：光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，陽性染色細胞<5%計0分，>5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%～75%計3分，>75%計4分。染色強度評分標準為：無染色計0分，呈淡黃染色計1分，呈黃染色計2分，呈棕黃染色計3分。陽性染色細胞百分比與染色強度得分的乘積即為免疫組化染色的總分，≤4分定義為陰性表達，>4分定義為陽性表達。

1.3觀察結(jié)局 術(shù)后對所有接受手術(shù)治療的NSCLC患者進行定期隨訪，通過查閱門診或住院病例及電話探訪等方式了解患者的生存狀態(tài)。研究以總體生存率(OS)作為主要觀察結(jié)局，將其定義為患者自手術(shù)之日起至術(shù)后因任何原因?qū)е滤劳龅臅r間段。截至末次隨訪，研究隊列無失訪病例，中位隨訪時間為26.7(15.5～39.0)個月。

2 結(jié) 果

2.1研究對象的基本特征 本研究系統(tǒng)收集了112例接受手術(shù)治療的NSCLC患者的一般資料與臨床病理特征，包括男67例(59.8%)和女45例(40.2%)，平均年齡(61.8±9.6)歲，59.8%(67/112)的患者有長期吸煙史；根據(jù)組織學(xué)類型，共有鱗癌52例(46.4%)，腺癌60例(53.6%)；全組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為57.1%(64/112)，根據(jù)第8版肺癌病理學(xué)TNM分期，共有Ⅰ期患者31例(27.7%)、Ⅱ期25例(22.3%)、Ⅲ期56例(50.0%)。

2.2UCH-L1在NSCLC樣本中的表達及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化染色顯示，UCH-L1蛋白在腫瘤組織中呈廣泛陽性表達或高表達，但在癌旁組織中呈陰性表達或低表達，見圖1。通過分析UCH-L1在112例配對NSCLC組織中的差異表達，發(fā)現(xiàn)UCH-L1在66.1%(74/112)的腫瘤組織中呈不同程度的陽性表達。

表1 UCH-L1蛋白在NSCLC及癌旁組織中的表達(免疫組化染色×200)

根據(jù)UCH-L1在NSCLC樣本中的表達水平，將所有患者分為高表達組(n=74)與低表達組(n=38)。UCH-L1表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。UCH-L1高表達組的組織學(xué)分級(G3:64.9%vs.44.7%,χ2=4.177,P=0.041)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(64.9%vs.42.1%,χ2=5.311,P=0.021)較低表達組更高，而腫瘤分期更為進展(TNM Ⅲ期:59.5%vs.31.6%,χ2=7.925,P=0.019)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者在年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)類型及T分期等變量分布上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為NSCLC；B為癌旁組織。圖1 UCH-L1表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3UCH-L1表達在NSCLC患者中的預(yù)后意義 112例NSCLC患者均被納入生存分析，隨訪期內(nèi)共37例(33.0%)患者觀察到主要結(jié)局事件，3年OS為54.5%。Kaplan-Meier生存曲線顯示，UCH-L1高表達組的3年OS顯著低于UCH-L1低表達組，分別為39.1%和78.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.181,P=0.002)。見圖2。

圖2 UCH-L1高表達與低表達者的Kaplan-Meier生存曲線

單因素分析的結(jié)果顯示，組織學(xué)分級(P=0.013)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)和UCH-L1表達(P=0.004)與NSCLC患者不良預(yù)后具有顯著相關(guān)性，見表2。

表2 NSCLC患者預(yù)后因素的Cox單因素分析

通過多因素分析調(diào)整潛在的混雜因素，本研究發(fā)現(xiàn)，UCH-L1高表達(HR=3.024,95%CI：1.311～6.973，P=0.009)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.092,95%CI：1.012～4.327，P=0.046)和組織學(xué)分級(HR=2.153,95%CI：1.062～4.363，P=0.033)仍然是3個具有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)后變量，是NSCLC患者不良OS的獨立預(yù)測因素。見表3。

表3 NSCLC患者預(yù)后因素的Cox多因素分析

3 討 論

作為一種去泛素化酶，UCH-L1的異常高表達已在多種惡性腫瘤中被報道，被認為是乳腺癌、前列腺癌的促瘤蛋白[21,24-25]。然而，也有研究在卵巢癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等其他樣本中發(fā)現(xiàn)了UCH-L1表達水平的下調(diào)[26-28]。因此，UCH-L1在人類癌癥中的表達水平及功能作用可能具有一定組織特異性。目前，尚不完全清楚UCH-L1在NSCLC樣本中的表達水平、臨床意義及其在惡性進展中的生物學(xué)功能。在本研究中，筆者應(yīng)用免疫組化染色法檢測了UCH-L1在112例NSCLC組織樣本中的表達情況，分析了其表達水平與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性，探討了UCH-L1作為NSCLC患者預(yù)后標志物的臨床價值。結(jié)果顯示UCH-L1蛋白在大多數(shù)NSCLC腫瘤樣本中呈陽性表達，并與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級顯著相關(guān)。這些研究表明UCH-L1或許在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起著決定性的作用，可能是腫瘤具有高侵襲性生物學(xué)行為的標志。生存分析進一步證實，UCH-L1高表達組的OS顯著低于低表達組，UCH-L1高表達水平是NSCLC患者預(yù)后不佳的獨立預(yù)測因素。因此，醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)在隨訪期間和制訂治療方案對這些患者予以特別關(guān)注。

SCHRODER等[14]通過組織微陣列技術(shù)證實了UCH-L1蛋白在1622例乳腺癌患者樣本中的高表達，并與雌、孕激素受體陰性及不良預(yù)后顯著相關(guān)，該研究與本文數(shù)據(jù)一致。JIN等[29]報道了UCH-L1表達在肝門部膽管癌中的表達及臨床意義，結(jié)果表明UCH-L1在62.1%的組織樣本中呈明顯過表達，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和血清CA19-9水平等腫瘤的侵襲性特征呈明顯正相關(guān)，是肝門膽管癌患者的預(yù)后預(yù)測因素。細胞功能實驗顯示，沉默UCH-L1表達可以抑制腫瘤細胞的生長與增殖。還有研究證實，沉默UCH-L1的表達通過阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲性[25]。盡管鮮有研究報道UCH-L1在NSCLC中的表達水平，但在一項之前的研究中，KIM等[30]通過體外細胞實驗證實UCH-L1可促進NSCLC細胞的惡性轉(zhuǎn)化與侵襲，表明UCH-L1可能作為一種癌蛋白在肺癌中發(fā)揮促癌作用。屈肖杰等[31]通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染下調(diào)UCH-L1表達水平后，也發(fā)現(xiàn)肺癌細胞系H157在體外的增殖能力明顯受限，細胞凋亡顯著增加。最近，有研究人員發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下，人肺癌細胞系A(chǔ)549中UCH-L1的表達水平顯著提升，同時增強了TGF-β/SMAD誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，促進肺癌的發(fā)生[32]。這些發(fā)現(xiàn)均表明，具有去泛素化活性的UCH-L1是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素，以UCH-L1作為靶點或許是一種有價值的肺癌治療策略。

綜上所述，這項研究證實了UCH-L1在可切除NSCLC患者中的異常高表達水平，這與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織學(xué)分級等侵襲性特征顯著相關(guān)。更為重要的是，UCH-L1水平可作為NSCLC患者的獨立預(yù)后分子標志。這些發(fā)現(xiàn)為進一步探索UCH-L1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供了依據(jù)，也為臨床醫(yī)生篩選高危人群、制訂治療方案提供了參考。