測值穩(wěn)定的抗人AMH單克隆抗體制備及應用*

何進軍，章成龍，葛超坤，鄒繼華，葉邦策

1.美康生物科技股份有限公司，浙江寧波 315104；2.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310014

抗繆勒氏管激素(AMH)是評估女性卵巢儲備及指導輔助生殖的主要標志物[1]，其臨床應用還包括卵巢早衰、絕經(jīng)年齡預測和多囊卵巢綜合征輔助診斷等[2-3]。AMH以二聚體表達，分泌前被酶切為N端與“成熟區(qū)”C端，N端與C端以非共價鍵結合[4]。研究表明血清中酶切與未酶切的AMH共存[5]。

1993年REY等[6]用自配的酶聯(lián)免疫試劑檢測發(fā)現(xiàn)，-20 ℃保存樣本AMH測值升高。2012年，RUSTAMOV等[7]用貝克曼AMH Gen Ⅱ試劑檢測并報告，樣本在室溫存放7 d及-20 ℃存放5 d測值分別上升58%、23%，且稀釋樣本測值與稀釋倍數(shù)不成比例。回顧性研究進一步證實，AMH測值上升幅度與樣本保存溫度、時間、保存方式(血清或全血)有關[8-9]。測值穩(wěn)定性是診斷試劑的重要指標，且臨床上常有樣本運輸和檢測不及時的情況，上述結果對AMH的廣泛應用造成了巨大困擾。有研究者推測樣本保存中AMH構象改變致使其與抗體結合能力上升或出現(xiàn)新的結合位點[7，9]，貝克曼的科學家則認為補體干擾AMH檢測，樣本保存后補體失活測值逐漸升高[10]。

筆者發(fā)現(xiàn)大量AMH單抗檢測室溫保存樣本測值升高，根據(jù)已有經(jīng)驗，僅少數(shù)抗體的補體結合位點容易暴露而易受干擾，因此推測AMH測值不穩(wěn)定非補體干擾而是分子構象改變所致，制備結合能力不受構象變化影響的單抗或可解決該問題。本文通過制備結合AMH不同位點的單抗以驗證該推測，并建立了滿足臨床要求的AMH化學發(fā)光檢測方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 抗體測值穩(wěn)定性檢測的400份樣本取自3天內(nèi)在寧波美康盛德醫(yī)學檢驗所體檢的400例12～50歲健康女性，混合分裝并-80 ℃凍存。測值相關性檢測的60份梯度樣本搜集于2021年9—10月。BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。研究過程遵循美康盛德醫(yī)學檢驗所倫理委員會相關原則，研究方案經(jīng)倫理委員會審核并批準。

1.2儀器與試劑 自配化學發(fā)光試劑，采用美康CL3080免疫分析儀檢測AMH，對照試劑盒Elecsys AMH(電化學發(fā)光法)及配套質(zhì)控品購自羅氏公司，使用Roche Cobas e602全自動免疫分析儀檢測。用于試劑特異性檢測的激活素A、抑制素A、促卵泡生成激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)均購自R&D Systems公司。

1.3方法

1.3.1人AMH抗原和單抗制備 AMH基因由金唯智生物科技有限公司合成，C末端添加8×His標簽，分別用 5′-NheⅠ、3′-EcoRⅠ酶切并插入pcDNA3.3質(zhì)粒。電轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)結束后用HisTrap FF柱及分子篩HiPrep Sepha S-300HR純化抗原。以AMH抗原(100 μg/只)免疫小鼠，3周后加強免疫3次(50 μg/只)，間隔2周。取小鼠脾細胞與SP 2/0細胞進行PEG 3000介導的細胞融合，酶聯(lián)免疫法檢測和篩選單克隆。

1.3.2AMH多肽合成 每條多肽長30個氨基酸，相鄰有5個氨基酸重疊，編號1～21，由吉爾生化(上海)有限公司合成。其中編號1～17位于AMH N端，編號18～21位于AMH C端，多肽17長26個氨基酸且與18不重疊，多肽21長39個氨基酸(見圖1C)。多肽耦聯(lián)BSA并用于抗體識別位點測定。

1.3.3發(fā)光試劑配置 發(fā)光試劑：取0.1 mg單抗，以分子數(shù)1∶15標記吖啶酯，室溫反應2 h，PB緩沖液透析3次，用PBS(1% BSA)稀釋至1 μg/mL備用。固相試劑：取0.1 mg單抗，以分子數(shù)1∶15標記生物素，室溫反應2 h，PB緩沖液透析3次，用PBS(1% BSA)稀釋至0.5 mg/mL備用。取0.5 mL磁珠，PB清洗3次，稀釋至5 mg/mL，加入等體積生物素標記抗體，室溫反應2 h，PBS (1% BSA) 清洗3次并稀釋至0.1 mg/mL備用。

1.3.4抗體配對及測值穩(wěn)定性測試 抗體對同時檢測空白對照(PBS，1% BSA)及陽性樣本并計算比值(信噪比)，信噪比大于10倍為有效配對。測試條件：1步法，100 μL發(fā)光試劑、50 μL固相試劑、30 μL樣本，37 ℃孵育15 min，清洗，檢測并記錄光度值。樣本第1天測值記為D0并于室溫(約25 ℃)保存，72 h后再次測試標記為D3。

1.3.5補體干擾檢測 C1q從枸櫞酸鈉抗凝血漿中純化，操作按照丁囯英等的方法進行[11]，濃度用美康公司補體C1q檢測試劑盒(免疫比濁法)測定。搜集AMH陰性樣本測定C1q水平，分別混合大于220 μg/mL(高)，大于170 μg/mL且小于220 μg/mL(中)及小于170 μg/mL(低)的樣本，各取一半混合樣本53 ℃、10 min滅活補體。滅活及未滅活樣本中均添加10 ng/mL AMH抗原，測試完成后滅活樣本添加終濃度300 μg/mL的C1q再次測試對測值的影響。抗體Fc段用胃蛋白酶酶切，protein G純化酶切后抗體。

1.3.6發(fā)光試劑分析性能測試 用PBS(1% BSA)梯度稀釋AMH抗原，羅氏Elecsys AMH試劑盒檢測并賦值。用抗體對260/80配置發(fā)光試劑，選擇賦值濃度在0.1～20 ng/mL內(nèi)的5點作為定標點，美康CL3080免疫分析儀定標及檢測樣本。分別檢測最低檢測線、測值相關性及特異度。特異度檢測分別測試含激活素A(100 ng/mL)、抑制素A(100 ng/mL)、FSH(200 IU/L)、LH(200 IU/L)的樣本，測值不高于0.1 ng/mL為無明顯交叉。

1.4統(tǒng)計學處理 測值穩(wěn)定性每個測試重復3次計算均值及比值，比值計算：光亮值(X天)/光亮值(0天)×100%，≥10%為顯著上升，<10%為測值穩(wěn)定。分析性能測試每個檢測重復2次并計算均值，相關性用線性方程擬合。用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，樣本測值穩(wěn)定性連續(xù)檢測及補體滅活、添加實驗、AMH抗原添加實驗數(shù)據(jù)分析采用獨立樣本t檢驗，并驗證方差齊性，自配試劑與羅氏試劑測值偏差分析采用成對樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1AMH抗原及單抗制備 鎳柱純化AMH抗原結果如圖1A所示，重組表達AMH包含二聚體及多聚體，還原后均變成單體。分子篩進一步純化可分別獲得多聚體及二聚體(圖1B)，二聚體組分用于免疫及克隆篩選。經(jīng)過4次融合，共獲得單克隆152株，抗體結合位點檢測結果見圖1C。共獲得21個多肽位點中15個位點的單克隆，6個位點(3、4、8、9、11、20)未獲得單克隆，3個位點(2、6、16)僅獲得1株單克隆。大部分單抗只結合1個位點，少數(shù)可結合2個以上的位點(按反應較強的位點計算)。

注：A為鎳柱純化AMH電泳，lane 1表示分子marker，lane 2表示非還原，lane 3表示還原(DTT)；B為分子篩純化AMH電泳，lane 1表示分子marker，lane 2表示過柱前，lane 3表示組分1(多聚體)，lane 4表示組分2(二聚體)；C為單抗位點檢測，橫軸表示多肽編號及氨基酸位點。圖1 AMH抗原及單抗制備

2.2室溫保存樣本測值穩(wěn)定的抗體對篩選 首先，挑選抗原反應較強的N端及C端抗體各20個，分別以C(捕獲)/N(檢測)及N(捕獲)/C(檢測)方式配對并檢測樣本測值穩(wěn)定性。結果C(捕獲)/N(檢測)方式可配對，除了1對抗體260(19)/152(14)測值穩(wěn)定，其他配對測值均顯著上升。N(捕獲)/C(檢測)方式未獲得有效配對。其次，以260(19)為包抗與所有N端抗體(檢抗)配對并檢測樣本測值穩(wěn)定性，結果如表1所示。14號位點(351～380氨基酸)的10個克隆測值均穩(wěn)定，17號位點(426～541氨基酸)5個克隆測值穩(wěn)定，5個克隆顯著上升。以152(14)為檢抗與所有C端抗體(包抗)配對并檢測樣本測值穩(wěn)定性，結果19號位點(477～501氨基酸)2個克隆測值穩(wěn)定，其余13個克隆均顯著升高。N端其他位點克隆作檢抗及C端其他位點克隆作包抗測值均顯著升高，部分結果如表2所示。克隆60(1)、133(12)同時作包抗及檢抗分別與260(19)及152(14)配對(表2)，兩個克隆作包抗或檢抗測值均顯著上升。最后，用4對測值穩(wěn)定且信噪比較高的抗體對260/361、260/45、260/80、260/152及測值顯著上升的抗體對260/56、260/33(對照)，分別在樣本保存第1、3、5、7天檢測測值穩(wěn)定性。結果如圖2所示，7 d后(D7)4對抗體測值均穩(wěn)定，對照抗體分別上升至155.5%及181.2%,與D0測值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：Dx測值與D0比值(3次檢測平均值，x=1、3、5、7)，260-80、260-33測值比值標于柱狀圖頂端；橫軸為樣本室溫保存時間。與D0測值比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；#為對照抗體對。圖2 抗體對測值穩(wěn)定性驗證Dx/D0(%)

表1 測值穩(wěn)定的單抗篩選

表2 不同位點單抗的測值穩(wěn)定性

2.3保存樣本測值升高由AMH構象改變而非補體干擾導致 由于補體干擾起始于C1q與抗體結合并激活補體系統(tǒng)，滅活AMH陰性樣本補體(圖3A)并向滅活前后樣本中添加AMH抗原，用測值上升的抗體對260/295、260/60檢測補體滅活對測值的影響。結果如圖3B所示，滅活后260/295測值無明顯改變，260/60測值下降且中、高補體樣本下降超過20.00%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。滅活樣本中添加C1q再次檢測，260/295測值沒有明顯改變，260/60測值上升至200.00%以上，與添加前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明260/60易受補體干擾導致測值升高，可預見樣本保存后補體失活其測值將下降，而260/295測值基本不受補體干擾，因此兩對抗體檢測室溫保存樣本測值升高均與補體干擾無關。

注：A為混合樣本補體滅活，表示為2次檢測均值，統(tǒng)計分析與滅活前比較；B為補體滅活及添加C1q對測值的影響滅活(-)表示未添加C1q，統(tǒng)計分析與未滅活比較；滅活(C1q)表示添加C1q，統(tǒng)計分析與滅活(-)比較；C為酶切抗體電泳,lane 1表示相對分子質(zhì)量marker；lane 2、4、6表示抗體295、49、60；lane 3、5、7表示酶切295、49、60；D為抗體酶切對測值穩(wěn)定性的影響(均值用“-”顯示)；E為AMH抗原對樣本測值上升的影響，血清表示陽性樣本；AMH表示重組AMH抗原；血清(AMH)表示陽性樣本添加AMH抗原。D3/D0表示第3天測值與第0天比值；B、D、E均為3次檢測均值;*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。圖3 樣本AMH測值升高原因

由于C1q結合位點在抗體Fc區(qū)，切除3對抗體260/295、260/49、260/60的檢抗Fc區(qū)(由2.2的結果可知3對抗體測值上升均由檢抗所致，見圖3C)并用未酶切及酶切的抗體檢測20份樣本的測值穩(wěn)定性。結果如圖3D所示，未酶切及酶切的295測值平均分別上升至209.70%、181.90%，抗體49及60測值分別上升至132.50%、132.80%及128.40%、129.30%，說明抗體測值上升不受Fc區(qū)影響，進一步證明保存樣本AMH測值上升非補體干擾導致。

另一方面，抗體對260/295檢測室溫存放AMH抗原測值并不上升(99.43%)，添加同樣濃度的抗原至陽性樣本并檢測測值穩(wěn)定性，未添加及添加抗原的樣本光度值分別上升267 022及210 788(圖3E)，偏差無統(tǒng)計學意義(P=0.104)。說明僅樣本中天然AMH分子在測值上升中起作用，重組AMH不能引起測值上升，且證明AMH測值升高并非樣本中干擾物如補體引起，雖然兩種來源的蛋白序列一樣但構象并不相同，樣本測值升高與AMH分子構象改變有關。

2.4抗體對260/80在人AMH化學發(fā)光檢測試劑中的應用 選擇測值穩(wěn)定且信噪比較高的抗體對260/80進行化學發(fā)光試劑配置及分析性能測試。以空白檢測限LoB評估，自配發(fā)光試劑的檢測靈敏度達0.08 ng/mL(表3)。自配試劑與羅氏電化學發(fā)光試劑同時檢測60份(0～30 ng/mL)樣本，兩種試劑測值有良好的相關性(圖4)，R2= 0.997 9，且測值偏差無統(tǒng)計學意義(P=0.264)。用TGF-β家族的激活素A、抑制素A及性激素FSH、LH檢測試劑特異度，自配試劑對4種干擾物均無明顯交叉反應(表4)。抗體對260/80配置的化學發(fā)光試劑檢測靈敏度、相關性、特異度均達到臨床要求。

表3 自配試劑檢測靈敏度

圖4 自配試劑與羅氏試劑測值相關性

表4 自配試劑檢測特異性(ng/mL)

3 討 論

AMH主要用于女性卵巢儲備及輔助生殖的診斷評估，具有廣闊的應用前景。AMH Gen Ⅱ試劑一度作為該指標的參考標準。2012年RUSTAMOV等[7]發(fā)現(xiàn)，AMH Gen Ⅱ試劑測值不穩(wěn)定的問題，推測樣本保存中非共價結合的N、C端逐漸解離并暴露新的抗體結合位點。2013年貝克曼在AMH Gen Ⅱ試劑中增加樣本稀釋步驟，認為補體干擾導致測值不穩(wěn)定，而樣本稀釋可以加速補體失活。隨后的研究證明，稀釋樣本致使AMH測值升高但明顯改善存放樣本的測值穩(wěn)定性[12-13]。自動化AMH檢測已進入臨床應用，貝克曼Access AMH通過整合樣本稀釋步驟，羅氏Elecsys AMH采用貝克曼的抗體，其解決測值穩(wěn)定性問題的方法尚不清楚[14]。雖然樣本檢測及時性及測值穩(wěn)定性都得到了較大改善，但從上游抗體原料解決AMH測值穩(wěn)定性問題對簡化檢測流程及AMH檢測的廣泛應用都具有重要意義。

本文的結果表明，包抗和檢抗均可導致樣本測值升高，切除引起測值上升抗體的Fc段后抗體對測值同樣升高，補體滅活及C1q添加試驗表明AMH測值升高與補體無關。AMH抗原測值并不升高與AMH Gen Ⅱ混合質(zhì)控測值穩(wěn)定的結果一致，添加至陽性樣本也沒有導致測值上升幅度增加[10]。這些結果均表明AMH測值不穩(wěn)定與其構象變化有關而非補體干擾引起。補體與抗體結合如果干擾抗原抗體結合將引起測值假性降低，如果把包抗與檢抗直接連在一起將導致測值假性升高，AMH Gen Ⅱ試劑可能屬于前者，但也可能稀釋樣本時AMH構象已經(jīng)改變。樣本AMH構象改變的機制需進一步研究，將有利于AMH功能調(diào)控的闡明。

本研究獲得了人AMH蛋白15個位點的單抗，其中14號位點全部克隆及17、19號位點部分克隆用于檢測室溫存放樣本測值穩(wěn)定，說明這3個位點全部或部分結構不易受AMH構象改變影響。有研究中并未測試所有可能的配對，也許沒有篩選出所有測值穩(wěn)定的配對；且有6個位點沒有獲得抗體，部分位點單抗較少，不排除這些位點的抗體也可用于AMH檢測且不受樣本保存影響。但本文的結果證明通過篩選特定位點單抗以解決AMH測值穩(wěn)定性問題的方法是可行的。本研究采用抗體對260/80制備的化學發(fā)光試劑檢測靈敏度、相關性、特異度均滿足臨床要求，為AMH廣泛應用于臨床檢測奠定了基礎。