結腸癌患者血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水平及腸道菌群的變化及其與復發(fā)轉移的關系*

周小翠，翁詩婷，許秋琳，劉國萍，謝國群

上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤二科,上海 200437

結腸癌是病發(fā)于人體消化系統(tǒng)的一類惡性腫瘤疾病，相關研究顯示其病發(fā)率呈逐年遞增趨勢，且該疾病預后較差，嚴重威脅患者的生命安全[1]。結腸癌多因患者生活習慣差、人體防御機制降低和外界環(huán)境干擾等因素誘發(fā)，且以上因素會影響腸道菌群，破壞腸道菌群結構的穩(wěn)定性，進而引發(fā)結腸癌[2]。既往研究顯示，腸道菌群狀態(tài)變化對結腸癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定介導作用，而這是通過其與下游信號分子之間聯(lián)系密切所致[3]。此外，腸癌患者在圍術期間或出現(xiàn)嚴重感染等刺激下，其腸道菌群狀態(tài)也會出現(xiàn)較大變化，若腸道狀態(tài)發(fā)生失調紊亂，很可能導致患者并發(fā)致慢性、低炎癥及腸道并發(fā)癥，進而延長恢復時間[4]。微小核糖核酸(miRNA)作為在眾多癌癥中均有所表達的重要基因，已經(jīng)成為臨床分子生物學治療領域下的一項研究工作熱點[5]。有研究結果指出，miR-139-3p和miR-377-3p在多類惡性腫瘤疾病中均呈異常表達[6-7]，提示上述兩項指標對惡性腫瘤細胞的活性及轉化等具有一定影響，但其在結腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用仍未明確。基于此，本研究探討了miR-139-3p、miR-377-3p表達水平及腸道菌群的變化與結腸癌患者臨床病理特征的關系，為臨床實現(xiàn)對早期結腸癌疾病的有效診斷及預測患者病情發(fā)展等提供有效標志物，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3月至2021年3月入本院接受根治術治療的結腸癌患者共126例作為結腸癌組，另選取同期在本院接受體檢的體檢健康者83例作為健康對照組。結腸癌組納入標準：(1)患者在本院就診期間臨床癥狀及相關診斷結果均符合結腸癌診斷標準[8]；(2)患者臨床病理資料完整；(3)患者入本院就診前未接受其他結腸癌相關治療方案；(4)預計術后生存時間≥3個月；(5)患者依從性較高，可配合本研究完成相關調查研究工作，直至研究結束。排除標準：(1)合并其他系統(tǒng)相關惡性腫瘤疾病；(2)合并嚴重心腦血管相關疾病或存在嚴重器質性功能障礙表現(xiàn)患者；(3)存在根治術禁忌證表現(xiàn)。術后針對結腸癌組患者展開為期1年的隨訪調查工作，根據(jù)患者術后病情發(fā)展情況建立亞組，其中發(fā)生復發(fā)轉移的患者納入復發(fā)轉移組，未發(fā)生復發(fā)轉移的患者納入未復發(fā)轉移組。兩組基線資料數(shù)據(jù)包括性別、年齡、體質量指數(shù)(BMI)等比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料數(shù)據(jù)差異對比[n(%)或

1.2方法

1.2.1血清miR-139-3p和miR-377-3p檢測方法 取所有受檢者空腹靜脈血8 mL，采用離心機(型號-H1850R，廣州滬瑞明儀器有限公司)以3 000 r/min行離心操作，之后取上清液，采用熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)方法對患者血清miR-139-3p和miR-377-3p進行檢測，采用Trizol法提取血清總RNA，采用qRT-PCR儀(MA-6000，濟南歐萊博技術有限公司)對miR-139-3p和miR-377-3p進行擴增。之后以U6為內參基因，用2-ΔΔCt法對miR-139-3p和miR-377-3p相對表達水平進行計算。針對本研究中納入的結腸癌患者展開隨訪工作，具體內容包括提醒患者每半年入院接受復查以評估其是否出現(xiàn)復發(fā)轉移。

1.2.2腸道菌群主要菌種檢測方法 收集結腸癌組患者術后第一次排便樣本及健康對照組入院體檢時糞便樣本，對糞便樣本中所有細菌的16SrRNA的V4～V5區(qū)通過Illumina MiSeq高通量測序平臺進行DNA測序，對腸道菌群的分布及豐度進行分析，同時做聚類分析。通過qRT-PCR法進行定量檢測：兩組中全部個體細菌數(shù)量以每克糞便中16SrRNA基因拷貝數(shù)的對數(shù)值來表示。

2 結 果

2.1對比兩組血清miR-139-3p和miR-377-3p的表達水平 結腸癌組血清miR-139-3p和miR-377-3p較健康對照組均呈更高表達，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水水平對比

2.2對比兩組腸道菌群狀態(tài)情況 結腸癌組術前、術后的雙歧桿菌數(shù)量均低于健康對照組，大腸桿菌數(shù)量均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組腸道菌群狀態(tài)情況對比

2.3結腸癌組不同臨床病理特征及其血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水平的關系 對所有患者進行為期1年的隨訪調查工作，結果顯示結腸癌組中不同性別、年齡、腫瘤部位患者血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；發(fā)生復發(fā)轉移、低分化、臨床分期處于Ⅲ期血清miR-139-3p和miR-377-3p較無復發(fā)轉移、中/高分化、臨床分析處于Ⅰ～Ⅱ期患者呈明顯高表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 結腸癌組不同臨床病理特征及血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水平的關系

續(xù)表4 結腸癌組不同臨床病理特征及血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水平的關系

2.4血清miR-139-3p、miR-377-3p表達水平與結腸癌臨床病理特征的相關性 結腸癌患者血清miR-139-3p、miR-377-3p表達水平與臨床分期、復發(fā)轉移均呈正相關，與臨床分化程度呈負相關(均P<0.05)，見表5。

表5 結腸癌患者miR-139-3p、miR-377-3p表達水平與分期、臨床分化程度、復發(fā)轉移的相關性

2.5對比不同復發(fā)轉移情況患者腸道菌群情況 復發(fā)轉移組患者雙歧桿菌數(shù)量較未復發(fā)轉移組明顯更低，大腸桿菌數(shù)量較未復發(fā)轉移組相比明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 不同復發(fā)轉移情況患者腸道菌群情況對比

2.6分析血清miR-139-3p、miR-377-3p與結腸癌患者大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的相關性 血清miR-139-3p、miR-377-3p與結腸癌患者大腸桿菌數(shù)量呈正相關，上述兩項指標與雙歧桿菌數(shù)量均呈負相關(均P<0.05)，見圖1～4。

圖1 miR-139-3p與大腸桿菌數(shù)量的相關性

圖2 miR-377-3p與大腸桿菌數(shù)量的相關性

圖3 miR-139-3p與雙歧桿菌數(shù)量的相關性

圖4 miR-377-3p與雙歧桿菌數(shù)量的相關性

3 討 論

臨床中以手術切除搭配放化療結合治療結腸癌為首選方案，腹腔鏡手術是近年來用于微創(chuàng)治療結腸癌的一項新型手術方式，對提高臨床手術效率具有顯著成效，需要注意的是，結腸癌患者術后的腫瘤復發(fā)及擴散轉移等不良預后事件仍是導致結腸癌患者治療失敗的重要原因[9]。相關研究表明，有較多miRNA均參與了結腸癌的發(fā)生與發(fā)展[10]。但二者用于預測診斷結腸癌發(fā)生及復發(fā)的臨床價值還有待研究。

本研究結果顯示，與健康對照組相比，結腸癌組血清miR-139-3p和miR-377-3p表達水平及腸道菌群均呈異常表達，臨床不同病理分期、腫瘤分化程度及不同復發(fā)轉移情況的患者，其血清miR-139-3p和miR-377-3p也呈現(xiàn)不同表達水平，經(jīng)過深入分析顯示血清miR-139-3p、miR-377-3p表達水平與臨床分期、復發(fā)轉移均呈正相關，與臨床分化程度呈負相關，提示血清miR-139-3p和miR-377-3p對結腸癌患者病情程度及復發(fā)轉移之間存在密切聯(lián)系。研究表明，miR-139-3p、miR-377-3p參與了淋巴結的發(fā)展與轉移，其在非小細胞肺癌組織中高表達[11]。分析其原因可能是結腸癌患者中診斷為高分期的患者病情進展程度更快，受機體惡性腫瘤影響，其惡性病變組織能夠釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA，并對機體中原有的具有抑癌性質的miRNA表達水平起到抑制作用，使得患者機體內具有原癌基因的miRNA表達水平異常升高，提示證實血清miR-139-3p、miR-377-3p與惡性結腸腫瘤病情程度密切相關，兩項指標的高表達狀態(tài)一定程度上加劇了惡性腫瘤細胞對淋巴結、臟器組織的浸潤能力，進而促使疾病進展，臨床分期上升的同時，誘發(fā)淋巴結轉移等[12-13]。

另有研究數(shù)據(jù)顯示，人體內腸道菌群狀態(tài)會對其健康狀況帶來影響，當機體處于正常運行狀態(tài)下，腸道菌群可處于平衡狀態(tài)并促進人體實現(xiàn)營養(yǎng)物質的有效吸收，抵御病原菌侵襲[14]。需要注意的是，若人體在飲食攝入等發(fā)生較大改變或機體處于感染、應激狀態(tài)下，有較大概率出現(xiàn)腸道菌群狀態(tài)紊亂，導致腸道細菌易位與內毒素侵入，加劇機體炎癥反應，進而并發(fā)各類并發(fā)癥，尤其是手術干預期與整個圍術期內應用多種抗菌藥物進行輔助治療時，可抑制患者機體腸道內正常微生物的發(fā)育，使耐藥菌及其他有害菌株過量繁殖，導致術后菌群結構而失衡[15]。針對術后患者腸道菌群系統(tǒng)失調的研究，在近年來的醫(yī)學文獻中較多，其可能是患者術后復發(fā)的主要原因[16-17]。本研究結果表明與健康對照組相比，腸道菌群狀態(tài)在術后出現(xiàn)失衡。結腸癌的具體病因和發(fā)病機制至今雖尚未明確，但較多研究結果均顯示腸道微環(huán)境調控在致消化道惡性腫瘤病變的蔓延和惡性轉移進程中發(fā)揮著重要作用，約20%的惡性腫瘤與細菌感染有關，腸道細菌能直接感染或間接參與腸道的食物代謝，同時生成一系列的致癌性代謝降解產(chǎn)物，最終導致惡性腫瘤復發(fā)[18-19]。

本研究對患者血清miR-139-3p、miR-377-3p表達水平及其腸道菌群狀態(tài)的影響機制進行深入分析，結果顯示兩項指標與腸道菌群狀態(tài)呈密切相關，VIRTUE等[20]研究顯示，部分miRNA與腸道菌群狀態(tài)紊亂及導致肥胖有關；張肖麗等[21]研究證實，針對結腸癌根治術后患者應用益生菌可改善腸道黏膜屏障功能，晉婷婷等[22]指出，結腸癌患者圍術期攝入適量益生菌在一定程度上可調節(jié)機體內miRNA表達水平，而這一機體反應對腸道黏膜屏障功能的提升具有積極作用，提示調節(jié)miRNA可改善腸道菌群狀態(tài)，這也從側面證實了miR-139-3p、miR-377-3p在腸道菌群穩(wěn)定中的作用。

結腸癌患者存在明顯的腸道菌群失調狀態(tài)，術后腸道菌群狀態(tài)紊亂程度加劇，血清miR-139-3p、miR-377-3p表達水平對結腸癌患者臨床分期、腫瘤分化及復發(fā)轉移等均密切相關，上述兩項指標的表達與腸道菌群狀態(tài)之間也有一定的聯(lián)系，提示測定血清miR-139-3p、miR-377-3p對結腸癌患者臨床診治中完善治療方案等具有一定的積極作用，并提供了一定的數(shù)據(jù)參考。