氮磷添加對草甸草原土壤氮磷轉化功能基因豐度的影響

肖 紅,劉玉玲,劉忠寬,李鵬珍,戎郁萍,*

1 中國農業大學草業科學與技術學院, 北京 100193 2 河北省農林科學院農業資源環境研究所, 石家莊 050051

氮(N)和磷(P)作為主要的營養元素,對調控陸地生態系統植物生產力和土壤微生物功能具有重要作用[1]。氮磷肥添加是提高過度放牧退化草地生產力和牧草品質的主要養分管理措施之一[2]。然而,過量的氮輸入會使土壤酸化、增加硝酸鹽淋溶損失和溫室氣體排放等[3]。由土壤氮轉化微生物驅動的土壤硝化和反硝化過程與硝酸鹽淋溶損失和N2O氣體排放緊密相關[4—6],因此,了解草原生態系統參與氮循環的主要土壤微生物功能群對養分添加的響應機理有助于草地養分調控,避免養分過量輸入引起的氮損失和溫室氣體排放[2]。

相對于氮轉化功能基因,磷轉化功能基因的研究較少。磷酸酶由堿性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)組成,是催化磷酸酯(除了肌醇磷酸酯,例如肌醇六磷酸鹽)水解釋放出磷酸鹽的酶。前人研究表明,ALP來自土壤微生物,而ACP主要由植物合成和分泌[18—19]。phoA、phoX和phoD是原核生物編碼ALP基因,這三個同源基因的分布隨生態系統不同而變化。phoA、phoD和phoX廣泛分布在水生生態系統,而陸地生態系統中phoD基因的分布要高于phoA和phoX[20]。因此,phoD基因可作為土壤有機磷轉化的標記基因[21]。Hu等[20]研究發現,長期添加高劑量有機肥(秸稈和牛糞)可顯著改變編碼堿性磷酸酶基因的細菌群落多樣性,phoD群落結構主要受土壤有機碳的調控,而不是土壤磷含量。Chen等[22]研究發現,長期添加磷肥增加了phoD基因的多樣性,phoD基因豐度與土壤有效磷含量負相關,而編碼堿性磷酸酶基因的細菌群落結構與土壤pH和有效磷含量有關。目前關于phoD基因的研究主要集中在農田生態系統中,且氮肥或氮磷肥同時添加對phoD基因豐度和多樣性的影響相對較少,phoD基因對氮、磷添加的響應機理尚不清楚。

本研究對氮、磷添加后呼倫貝爾草甸草原不同生長時期土壤氨氧化(amoA-AOA和amoA-AOB)、反硝化(narG、nirK、nirS和nosZ)和磷轉化(phoD)基因豐度進行分析,探究土壤理化性質與氮、磷轉化功能基因豐度的關系,明確土壤氮、磷轉化功能基因豐度及氮損失對氮、磷添加的響應規律,為定向調控土壤氮、磷轉化過程,提高養分利用效率,減少溫室氣體N2O排放提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究地點位于呼倫貝爾市海拉爾區特尼河9隊(49°20′—49°26′N,119°55′—120°9′E,海拔628—649 m),是大興安嶺西麓丘陵向內蒙古高原的過渡區。該地區屬溫帶大陸性季風氣候,年均溫-1.2 ℃,1月最冷月平均氣溫-25.9 ℃,7月最熱月平均氣溫20.0℃,>10 ℃積溫1780—1820℃,無霜期90—115 d,年均降水量354 mm,全年降水的75%集中在6—9月份。2018—2020年總降水量分別為289.0 mm、279.0 mm、357.0 mm。草甸草原以羊草(Leymuschinensis)和貝加爾針茅(Stipabaicalensis)建群,土壤為黑鈣土或暗栗鈣土,土壤pH為6.50,土層厚30—40 cm,表層土壤(0—10 cm)有機碳含量51.0 g/kg,全氮3.7 g/kg,全磷0.5 g/kg。

1.2 試驗設計

2018年5月在試驗區選取地勢平坦、植被分布均勻的草地進行氮磷添加試驗,雙因子裂區試驗設計,主區為氮添加,副區為磷添加。設5個氮水平(N0:不施N；N1:1.55 g N m-2a-1；N2:4.65 g N m-2a-1；N3:13.95 g N m-2a-1；N4:27.9 g N m-2a-1),3個磷水平(P0:不施P；P1:5.24 g P m-2a-1；P2:10.48 g P m-2a-1),共15個處理,4個區組,總計60個小區。每個小區面積2 m×3 m,主區間距2 m,副區間距1 m。氮的添加量參考前人在內蒙古草地進行的氮添加梯度(0—30 g N m-2a-1)[23],1.55 g N m-2a-1的添加量近似等于2000—2010年中國年平均氮沉降量[21],13.95 g N m-2a-1的添加量可達到內蒙古草地植物生長的氮飽和閾值[24]。磷的添加量也參考前人在內蒙古草地進行的磷添加梯度(0—13.9 g P m-2a-1)[25],本研究磷添加量能解除內蒙古草地植物生長磷限制[25]。氮肥使用硝酸銨(NH4NO3,分析純),磷肥使用五氧化二磷(P2O5,分析純)。添加時間為2018—2020年,每年6月6日進行氮磷添加。將肥料溶解在24 L水(相當于4 mm的降水)中,以水溶液的形式用噴壺均勻噴施于試驗小區,不施肥的小區噴施等量的水。按照當地打草場的利用方式,每年8月底對處理小區進行刈割處理,留茬高度為8 cm。

1.3 土壤樣品采集

2020年5月下旬(施肥前,5月28日)、7月和8月中旬(7月15日,8月20日),用直徑5 cm的土鉆在每個小區內隨機取0—10 cm土樣4個,混合成1個土壤樣品,過2 mm篩后分成三份,一份用于測定土壤含水量,另一份儲存于-80 ℃冰箱用于土壤DNA的提取,剩余的土壤自然風干后測定土壤化學性質。

1.4 土壤理化性質測定

土壤全碳(TC)和全氮(TN)用元素分析儀(Vario MAX CN; Elementar, Hanau, Germany)測定。

土壤全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)采用鉬銻抗比色法測定[26]。

土壤pH用酸度計(FE20-FiveEasyTM, Mettler Toledo, Germany)測定。

1.5 土壤DNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈式反應分析(qRT-PCR)

土壤DNA提取采用土壤基因組DNA提取試劑盒(DP336,天根,中國)。采用羅氏LightCycle 96的實時定量聚合酶鏈式反(PCR)儀對16SrRNA、phoD、amoA-AOB、amoA-AOA、narG、nirK、nirS和nosZ基因拷貝數進行分析。qRT-PCR分析采用熒光定量試劑盒SuperReal PreMix Plus (SYBR Green),總反應體系為20 μL,包括:10 μL的 2×SuperReal SYBR Green PreMix Plus,0.5 μL上游引物(10 μM),0.5 μL 下游引物(10 μM),5 μL的DNA模板和4 μL的ddH2O。所有基因引物合成序列信息和相應的PCR擴增程序參照之前的文獻報道[12,20]。

1.6 數據分析

采用三因素方差分析檢驗氮添加(N),磷添加(P)與不同取樣時間(D)的主效應及其交互作用對土壤理化指標及氮、磷轉化功能基因拷貝數的影響。采用裂區方差分析檢驗每個取樣時間下氮、磷添加及其交互作用對土壤理化指標及氮、磷轉化功能基因拷貝數的影響,其中氮水平和磷水平作為固定因子,區組為隨機因子。采用鄧肯(Duncan)多重比較(P<0.05)檢驗氮或磷添加水平間的差異,方差分析均使用SPSS(version 19.0; IBM, Armonk, New York, USA)進行。采用冗余分析(RDA)評估不同取樣時間下氮、磷轉化功能基因拷貝數與土壤理化指標間的關系。數據作圖采用GraphPad(version 8.0.1, GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)進行。

2 結果與分析

2.1 氮磷添加對土壤理化性質的影響

表1 三因素方差分析氮添加(N)、磷添加(P)、取樣時間(D)及其交互作用對土壤理化性質的影響Table 1 Results of multi-factor ANOVA analysis showing the effects of nitrogen addition, phosphorus addition, sampling dates and their interactions on soil properties

表2 氮添加(N)、磷添加(P)及其交互作用對不同月份土壤理化性質的影響Table 2 Results of split-plot analysis of variance showing the effects of nitrogen addition, phosphorus addition, and their interaction on soil properties in different sampling dates

氮、磷添加對土壤TC、TN含量和TC:TN比的影響不顯著(表1,P>0.05),顯著影響土壤TP含量、TC:TP和TN:TP(表1,P<0.01)。磷添加顯著增加了TP含量(表2,P<0.001),降低了土壤TC:TP比和TN:TP比(表2,P<0.001),氮添加降低TP含量(表2,P<0.05),提高TC:TP比和TN:TP比(表2,P<0.05)。

土壤pH受到氮、磷添加交互作用的顯著影響(表1,P<0.01),氮、磷單獨添加均可降低土壤pH(表2,P<0.01),高氮水平下添加磷對土壤pH的降低不明顯。土壤水含量(SWC)受氮、磷添加和取樣時間交互作用的顯著影響(表1,P<0.05),氮添加可顯著降低5月份SWC,高氮水平下,磷添加可降低SWC(表2,P<0.01)。7月份SWC低于5月和8月份。

2.2 氮磷添加對土壤細菌和磷酸酶基因豐度的影響

氮、磷添加及其交互作用對土壤細菌豐度(16S rRNA)的影響不顯著(表3,P>0.05),但不同取樣時間16S rRNA基因豐度差異顯著(表3,P<0.05),5月份16S rRNA基因豐度整體高于7、8月份(圖1)。土壤磷酸酶基因(phoD)不受氮、磷添加及取樣時間的影響(表3,P>0.05)。

表3 三因素方差分析氮添加(N)、磷添加(P)、取樣時間(D)及其交互作用對土壤氮、磷轉化功能基因表達豐度的影響Table 3 Results of multi-factor ANOVA analysis showing the effects of nitrogen addition, phosphorus addition, sampling dates and their interactions on the abundance of functional genes involved in soil N and P cycling

圖1 氮磷添加對不同取樣時間土壤細菌和磷酸酶基因豐度的影響Fig.1 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the abundances of bacteria and phosphatase gene in different sampling datesN0:0 g N m-2 a-1；N1:1.55 g N m-2 a-1；N2:4.65 g N m-2 a-1；N3:13.95 g N m-2 a-1；N4:27.9 g N m-2 a-1；P0:0 g P2O5 m-2 a-1；P1:12 g P2O5 m-2 a-1；P2:24 g P2O5 m-2 a-1;不同大寫字母表示氮效應顯著；不同小寫字母表示磷效應顯著;ns,*,**,***分別代表P>0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.001

2.3 氮磷添加對土壤氨氧化功能基因豐度的影響

土壤amoA-AOA和amoA-AOB基因表達豐度對氮、磷添加及取樣時間的響應不同,不同取樣時間下amoA-AOA基因拷貝數均未受到氮、磷添加及其交互作用顯著影響(圖2,P>0.05),但5月份的amoA-AOA基因拷貝數低于7月份和8月份。amoA-AOB基因拷貝數不受取樣時間的顯著影響(表3,P>0.05)。氮添加可顯著增加5—8月份amoA-AOB基因拷貝數(P<0.05),且8月份高氮處理(N3和N4)下的作用效果更為顯著(P<0.001)(圖2)。5月份N2和N3處理下,磷添加(P2)可顯著降低amoA-AOB基因拷貝數。氮、磷添加對8月份amoA-AOB基因拷貝數的影響存在交互作用,高氮水平下,磷添加可降低amoA-AOB基因拷貝數(圖2，P<0.05)。

土壤amoA-AOA和amoA-AOB基因表達豐度的比值(AOA:AOB)受到氮、磷添加及取樣時間三者交互作用的顯著影響(表3,P<0.05)。氮添加對5—8月份AOA:AOB均有顯著影響(圖2,P<0.01),高氮處理(N4)可顯著降低AOA:AOB(圖2,P<0.05)。氮、磷添加對7月和8月AOA:AOB的影響具有交互作用,低氮處理下,磷添加可降低AOA:AOB,而高氮處理下添加磷可提高AOA:AOB(圖2,P<0.05)。磷添加對5月份的AOA:AOB無顯著影響(圖2,P>0.05),而氮添加對5月份AOA:AOB的影響呈先升高后降低的趨勢。

圖2 氮磷添加對不同取樣時間土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌amoA基因豐度及比值的影響Fig.2 Effects of nitrogen and phosphorus additions on amoA abundance of ammonia oxidizing archaea and ammonia oxidizing bacteria and their ratios in different sampling datesAOA:AOB:土壤氨氧化古菌與氨氧化細菌的比值 the ratio of amoA-AOA to amoA-AOB

2.4 氮磷添加對土壤反硝化功能基因豐度的影響

取樣時間顯著影響反硝化基因nirK拷貝數(表3,P<0.001),8月份nirK拷貝數高于5月和7月份,且高氮(N3)處理的nirK拷貝數顯著高于N0處理(圖3,P<0.05),氮、磷添加對5月和7月份nirK拷貝數的影響不顯著(圖3,P>0.05)。nirS拷貝數不受氮、磷添加及取樣時間的影響(圖3,P>0.05)。氮、磷添加及取樣時間對7月和8月份nirK:nirS的影響也不顯著(圖3,P>0.05),但氮、磷交互作用對5月份nirK:nirS的影響顯著,高氮處理(N3)可顯著降低nirK:nirS,單獨磷添加可顯著增加nirK:nirS,而N2處理下磷添加可顯著降低nirK:nirS(圖3,P<0.05)。氮、磷添加對5—8月份narG拷貝數無顯著影響(圖4,P>0.05),氮添加對5月和7月份nosZ拷貝數的影響不顯著,N2和N3處理可顯著增加8月份nosZ的拷貝數(圖4,P<0.05)。

圖3 氮磷添加對不同取樣時間土壤反硝化功能基因nirK、nirS豐度及其比值的影響Fig.3 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the abundances of nirK and nirS involved in denitrification and their ratios in different sampling dates

圖4 氮磷添加對 取樣時間土壤反硝化功能基因narG、nosZ豐度的影響Fig.4 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the abundances of narG and nosZ involved in denitrification in different sampling dates

2.5 氮磷添加對土壤氮損失潛勢的影響

土壤硝酸鹽滲漏潛勢(amoA:narG)受到氮、磷添加、取樣時間及其交互作用的影響(表3,P<0.05)。氮添加可增加5—8月份amoA:narG,5月和7月amoA:narG受到氮磷添加交互作用的影響(圖5,P<0.05)。5月份,N2、N3和N4處理下添加磷可降低amoA:narG；7月份,N2處理下添加磷可降低amoA:narG(圖5,P<0.05)。不同時間土壤氣態氮損失潛勢(nirK+nirS)有差異(表3,P<0.001),8月份nirK+nirS高于5月和7月份,且高氮(N3)處理的nirK+nirS顯著高于N0處理(圖5,P<0.05),氮、磷添加對5月和7月份的nirK+nirS影響不顯著(圖5,P>0.05)。

圖5 氮磷添加對不同取樣時間土壤氮損失潛勢的影響Fig.5 Effects of nitrogen and phosphorus additions on the potential of soil N loss in different sampling dates

2.6 土壤理化性質與氨氧化和反硝化基因豐度的關系

圖6 冗余分析(RDA)土壤理化性質與氨氧化和反硝化基因豐度的關系Fig.6 The redundancy analysis (RDA) showing the relationship between the soil properties and the abundance of genes involved in ammonia oxidation and denitrification土壤銨態氮 soil ammonium 土壤硝態氮 soil nitrate；Olsen-P:土壤速效磷 soil available phosphorus；TC:土壤總碳 soil total carbon；TN:土壤總氮 soil total nitrogen；TP:土壤全磷 soil total phosphorus；TC:TN:土壤全碳與全氮的比值 the ratio of soil total carbon to soil total nitrogen；TC:TP:土壤全碳與全磷的比值 the ratio of soil total carbon to soil total phosphorus；TN:TP:土壤全氮與全磷的比值 the ratio of soil total nitrogen to soil total phosphorus；SWC:土壤含水量 soil water content

3 討論

3.1 土壤氨氧化和反硝化基因豐度對氮、磷添加的響應

nirK或nirS編碼的亞硝酸鹽還原酶催化由亞硝酸鹽還原成NO的過程,是土壤中氣態氮損失和N2O排放的重要途徑[9]。不同的生態系統nirK和nirS基因的相對豐度不同,一些農田生態系統中,nirS基因豐度顯著高于nirK基因豐度,亞硝酸鹽還原過程主要是由nirS型細菌驅動[35—36]。然而,本研究中nirK基因豐度顯著高于nirS基因豐度(nirK:nirS>1),這說明nirK型細菌是該生態系統亞硝酸鹽還原過程的主要驅動者,其他草原生態系統中也發現nirK基因豐度高于nirS基因豐度[2, 11]。但nirK和nirS基因豐度對氮添加的響應也存在不一致性[2—3, 35]。本研究發現nirS基因豐度比較穩定,不受氮添加和取樣時間的影響,nirK的豐度對氮添加的響應受到取樣時間的影響,氮添加只有在8月份對nirK基因豐度具有顯著的促進作用,且8月份nirK的豐度顯著高于5和7月。Azziz等[37]研究表明,植物生長時期是nirS和nirK基因豐度的主要影響因素。在冬小麥田的研究中也發現,nirS和nirK基因豐度在開花期對氮磷添加的響應更明顯,而在其他生長時期氮磷添加對nirS和nirK基因豐度的影響不顯著[4]。土壤反硝化細菌受到許多環境因子的影響,比如碳的可利用性、土壤濕度和pH等[38]。Tang等[3]認為礦質氮含量的增加引起的土壤酸化和鹽分離子的富集可能是氮添加導致nirS和nirK基因豐度降低的原因。本研究RDA的結果表明,nirK+nirS基因豐度與SWC正相關,與pH負相關(圖6)。同時,8月份SWC和nirK的豐度最大,這說明在土壤濕度高的情況下可促進土壤反硝化過程。

3.2 氮、磷添加對土壤氮損失潛勢的影響

3.3 土壤磷轉化phoD基因豐度對氮、磷添加的響應

長期施磷肥(28年)的玉米田,土壤磷的有效性與堿性磷酸單酯酶活性、phoD基因豐度呈負相關關系,即堿性磷酸單酯酶活性受土壤有效磷的調控[22]。因此,在缺磷時堿性磷酸單酯酶活性和phoD基因豐度會增加[43—44]。然而,Ikoyi等[45]通過短期溫室試驗發現,phoD基因豐度與土壤有效磷之間沒有顯著的相關關系。本研究發現,土壤有效磷含量的變化并沒有導致phoD基因豐度的改變,phoD基因豐度不受氮、磷添加的影響。這種不一致性可能與這些研究中施磷的時間和數量有關,長期施肥對土壤微生物群落結構的影響更為顯著[46]。此外,Hu等[20]通過長期(10年)的有機肥處理發現,土壤中phoD基因豐度明顯增加,然而,phoD與16S rRNA基因豐度的比值卻在所有處理中無顯著差異,這表明長期施用有機肥促進了整個土壤細菌的生長,而不僅僅是phoD型細菌的生長。本研究中氮、磷添加對16S rRNA基因的豐度也沒有顯著影響,這說明短期的氮、磷添加試驗并不會引起呼倫貝爾草甸草原土壤phoD與16S rRNA基因豐度的改變。

4 結論

本研究發現,呼倫貝爾草甸草原土壤細菌16S rRNA、磷酸酶基因phoD、氨氧化古菌amoA-AOA、反硝化基因nirS和narG豐度相對比較穩定,而反硝化基因nirK和nosZ豐度對氮添加的響應受到生長季節的調控,且與土壤含水量的變化緊密相關。土壤濕度較大時,氮添加可增加nirK豐度,提高土壤氣態氮損失潛勢。土壤氨氧化細菌amoA-AOB豐度受氮磷添加的共同調控,氮添加通過增加amoA-AOB基因豐度增強了土壤硝酸鹽淋溶損失潛勢,而高氮處理下添加磷可減小硝酸鹽淋溶損失潛勢。因此,磷添加對提高土壤氮的利用效率具有重要作用,但有關氮磷添加協同調控土壤氮損失的機制還需要深入探究。