桑葉蛋白的提取及應(yīng)用分析

張芯，王傲

（1. 安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 安康 725000；2. 安康學(xué)院 陜西省富硒食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，陜西 安康 725000；3. 安康市納米新材料工程技術(shù)研究中心, 陜西 安康 725000）

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)蛋白質(zhì)的需求也在不斷增加，尋找新的蛋白質(zhì)來源也引起了越來越多研究者的興趣[1]。葉蛋白，一種可溶性蛋白的凝集物，是將植物莖葉經(jīng)過壓榨、蛋白質(zhì)分離等操作而得到的蛋白質(zhì)濃縮物，其可以替代較為昂貴的谷物和動(dòng)物蛋白質(zhì)[2]。此外，葉蛋白已經(jīng)成為許多發(fā)展中國(guó)家的主要食物蛋白質(zhì)來源。迄今為止，自然界中許多植物的葉子已經(jīng)成為葉蛋白的提取對(duì)象[3-4]。

桑葉，桑樹的樹葉，是家蠶的食物，因其具有疏散風(fēng)熱、清肝明目的功效，被國(guó)家衛(wèi)生部列為藥食兩用植物。此外，桑葉因其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被作為功能性食品食用，如桑葉飲料、桑葉茶、桑葉面條等多種產(chǎn)品[5-9]。研究表明，桑葉富含多糖、生物堿等生物活性物質(zhì)[10-12]，除此之外，桑葉中還含有豐富的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可占干基重的15%以上[13]，氨基酸種類齊全，因此桑葉蛋白可作為一種待開發(fā)的天然保健產(chǎn)品。本文就目前桑葉蛋白的提取及應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行分析，這對(duì)于提升桑葉的附加價(jià)值具有重要的意義。

1 桑葉蛋白的提取

1.1 酸堿沉淀法

酸堿沉淀法一般是對(duì)提取對(duì)象進(jìn)行浸提之后，用鹽酸或氫氧化鈉或氨水等調(diào)整液汁的pH 值，再加熱使蛋白質(zhì)絮凝沉淀下來的方法。該方法也是最為常用的葉蛋白提取方法。楊晶[14]等利用NaOH 溶液浸提桑葉粉末，結(jié)合超聲處理20 min 后，在40 ℃下浸提1 h，再以HCl 溶液調(diào)節(jié)提取液的pH為3，產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀，得到粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%左右。王芳[15]等也用類似的酸沉淀法得到桑葉蛋白，其中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.7%。王桃云[16]等以桑樹鮮葉為原料，在pH 為8 的水溶液中浸提4 min，提取液選用HCl、NaOH 分別調(diào)節(jié)至pH 為5、8 和13，絮凝溫度為75 ℃，得到鮮葉的葉蛋白得率為5.17%（合干葉葉蛋白得率18.98%）。劉信寶[17]等對(duì)飼料桑葉葉蛋白提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，飼料桑葉蛋白浸提率在不同處理下存在差異，其葉蛋白最適浸提條件為：浸提溫度為 40 ℃，料液比為 1∶16，浸提液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的NaOH 溶液，浸提時(shí)間為 25 min。總體上說，酸堿沉淀提取法操作較為簡(jiǎn)單，成本也比較低廉，但是得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度不高。

1.2 鹽析法

鹽析法是指利用提取液中每種物質(zhì)在不同離子濃度的鹽溶液中分別沉淀析出，從而分離蛋白質(zhì)的一種方法。喬璐[18]研究發(fā)現(xiàn)，在提取液中加入0.4%的NaCl 時(shí)，蛋白質(zhì)得率較不加鹽時(shí)提高了37%，但當(dāng)NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.4%時(shí)，提取率又開始下降，大概是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)基團(tuán)帶正電荷時(shí)，與溶液中帶負(fù)電荷的陰離子結(jié)合，這樣會(huì)增加蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，使得蛋白質(zhì)的溶解性也增大了[19]，但鹽濃度過大，又會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度下降，進(jìn)而提取率降低。張智強(qiáng)[20]利用硫酸銨為鹽析試劑提取桑葉蛋白，當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)50%，蛋白質(zhì)的提取率最高，之后隨著硫酸銨的飽和度增加，提取率反而降低。孫崇臻[21]等采用酸熱法、酸沉法、鹽析法等不同的方法沉淀桑葉蛋白，發(fā)現(xiàn)酸熱法制備葉蛋白提取率最高，為39.9 %，鹽析法的提取率為38.6%，與最高提取率接近。鹽析所用試劑為硫酸銨，最佳飽和度為65%，鹽析法得到的桑葉蛋白純度最高，且此方法提取得到的蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性、乳化性和吸油性均優(yōu)于其他提取方法得到的蛋白質(zhì)。

1.3 發(fā)酵法

發(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的物質(zhì)使得蛋白質(zhì)沉淀析出的方法。其特點(diǎn)是不需要加熱，也不會(huì)產(chǎn)生廢物及污染物質(zhì)。屈紅森[22]等采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵法提取干桑葉中的蛋白質(zhì)，在最佳的發(fā)酵條件下，桑葉蛋白的得率為16%，與未經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵組對(duì)比，其蛋白得率提高了10.57%，且用發(fā)酵法提取的桑葉蛋白的體外消化能力有所提高。任元元[23]等利用枯草芽孢桿菌、米曲霉、釀酒酵母及植物乳桿菌作為復(fù)合菌種，混合發(fā)酵，提高了桑葉蛋白質(zhì)的利用率，提高了桑葉中可溶性蛋白質(zhì)和氨基態(tài)氮含量。發(fā)酵法可以提高桑葉蛋白得率，還在一定程度上改善了桑葉蛋白的品質(zhì)，結(jié)合其本身節(jié)能、環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，最適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，因此，發(fā)酵法提取桑葉蛋白當(dāng)屬目前最有實(shí)用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種提取方法。目前，此提取方法面臨的主要困難是如何進(jìn)一步有效分離得到的疏松絮狀沉淀產(chǎn)物。

1.4 超聲波（微波）輔助提取法

超聲波技術(shù)是一種物理提取方法，在葉蛋白的提取過程中，通過超聲波破壞細(xì)胞壁，提高細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出速率，縮短提取時(shí)間，具有快速、高效且不破壞物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)。王芳[24]等采用超聲波輔助提取干桑葉粉中的蛋白質(zhì)，得到最佳提取條件為：料液比選用1∶30，提取劑選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的氯化鈉溶液，超聲波 400 W 超聲處理20 min，40 ℃水浴浸提 60 min，桑葉葉蛋白得率為9.93%，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.8%。李剛鳳等以類似的工藝條件，采取超聲波輔助提取桑葉粉中的蛋白質(zhì)，桑葉蛋白的平均提取率達(dá)5.18%。SUN[25]等采用超聲波輔助 Osborne 法提取桑葉蛋白，得到桑葉中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為243.41 g·kg-1。殷培峰[26]等利用超聲波輔助提取桑葉蛋白，最佳提取條件下，輔以400 W 超聲波，蛋白提取率為 9.52%。劉苗苗[27]等采用超聲法提取桑葉中的蛋白，發(fā)現(xiàn)不同的超聲溫度、超聲時(shí)間都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的提取率產(chǎn)生影響。超聲波輔助提取在一定程度上優(yōu)化了蛋白質(zhì)的提取方法，節(jié)省時(shí)間，節(jié)約能源，與常規(guī)的水提法相比，該提取方法也能大大提高桑葉蛋白的得率。

微波輔助提取法是利用微波能加熱來提高提取率的一種技術(shù)。鄧翔[28]等在堿法提取桑葉蛋白的基礎(chǔ)上，利用微波輔助提取方法探索不同條件下從桑葉粉中提取葉蛋白的效果。通過對(duì)比料液比、微波時(shí)間、微波功率等因素對(duì)桑葉蛋白提取率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微波提取時(shí)間設(shè)為82 s，微波功率設(shè)為500 W，桑葉蛋白的提取率可達(dá)35.84%。在其他提取蛋白質(zhì)方法的基礎(chǔ)上，輔以微波技術(shù)，可以大幅度縮短提取時(shí)間，提高效率。

1.5 超濾法

超濾法是指以一定的外界壓力為推動(dòng)力，一定孔徑的薄膜作為分離介質(zhì)，將溶液中的物質(zhì)按照分子量的大小進(jìn)行分離的方法。該方法一般用于脫鹽、濃縮等領(lǐng)域，有時(shí)，也可用于分離純化領(lǐng)域[18]。此方法的研究工作較少，楊田[29]等利用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液結(jié)合超濾濃縮法提取鮮桑葉葉蛋白，具體做法是使用截留分子量為5 000 Da 的中空纖維超濾膜將提取的清液超濾濃縮，經(jīng)冷凍干燥得蛋白粉。該方法證明了桑葉葉蛋白可以不運(yùn)用變性的方式提取，超濾法提取桑葉蛋白提高了蛋白質(zhì)的品質(zhì)，是桑葉蛋白提取工藝的一次創(chuàng)新。

2 桑葉蛋白的應(yīng)用價(jià)值

桑葉中蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸種類齊全。據(jù)文獻(xiàn)[30]報(bào)道，一些品種的桑葉蛋白中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為144.1 mg·g-1，包括異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等在內(nèi)的7 種動(dòng)物機(jī)體必需氨基酸，必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.5 mg·g-1，占到總氨基酸含量的42.7%。

2.1 食品領(lǐng)域

楊晶[14]等優(yōu)化了桑葉的干燥方法、桑葉蛋白浸提劑種類以及桑葉蛋白質(zhì)的沉淀方法，得到了較佳的桑葉蛋白質(zhì)提取及蛋白粉制備工藝，制得的蛋白粉不含有動(dòng)物性膽固醇，可作為人類的食用蛋白質(zhì)資源。祁芳[31]等以桑葉浸提液為原料研制出桑葉蛋白飲品，探究桑葉浸提液、白砂糖、檸檬酸等對(duì)桑葉蛋白飲品質(zhì)量的影響，最終得到桑葉飲品的最佳配方。這些研究工作都為桑葉蛋白的應(yīng)用及深度開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2 抗氧化劑

研究表明，桑葉蛋白的自由基清除活性較高，尤其是清蛋白具有良好的抗氧化活性，抗氧化活性與蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)，桑葉蛋白可以用作天然的抗氧化添加劑[25]。孫崇臻[32]的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)桑葉蛋白酶解物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，分別采用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶在內(nèi)的等6 種蛋白酶對(duì)桑葉蛋白質(zhì)進(jìn)行單酶酶解及雙酶、三酶復(fù)合酶解。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶制備出的桑葉蛋白酶解物具有明顯的抗氧化物活性，且抗氧化活性都要高于未酶解前的桑葉蛋白。這與余剛[33]等的研究結(jié)果相似，酶解后的桑葉多肽具有良好的抗氧化性，體外抗氧化測(cè)試表明，桑葉多肽的抗氧化活性要高于未酶解的桑葉蛋白。喬璐[18]測(cè)定了桑葉蛋白水解肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其具有良好的還原性能，桑葉蛋白水解肽對(duì)2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（O2·）以及羥自由基（·OH）等具有明顯的捕獲能力，在亞油酸自氧化體系中也表現(xiàn)出較顯著的抑制能力。尤其是采用堿性蛋白酶水解得到的桑葉蛋白水解肽具有良好的還原性，當(dāng)水解肽質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg·mL-1時(shí)，清除率已經(jīng)高達(dá)91.49%，與質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的Vc 的還原能力相當(dāng)，具有抗衰老的功效。以上的研究工作都為加強(qiáng)桑葉蛋白的抗氧化活性、進(jìn)一步提高其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值提供了理論依據(jù)。

2.3 醫(yī)藥領(lǐng)域

桑葉蛋白所含氨基酸種類齊全，尤其谷氨酸和天冬氨酸含量較高[15]。谷氨酸和天冬氨酸分別可用于治療肝功能不全、改善心肌收縮等方面。桑葉蛋白還可應(yīng)用于降血壓方面。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是導(dǎo)致血壓升高的主因之一。ACE 抑制肽是一類能夠使血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性受到抑制的多肽，臨床應(yīng)用安全可靠，是ACE 抑制劑研究領(lǐng)域的新方向[34-35]。賈漫麗[36]等利用酶解法制備桑葉蛋白多肽，以ACE 抑制率為主要指標(biāo)，研究桑葉多肽對(duì)ACE 抑制活性的影響。結(jié)果表明，酶解效果最佳的酶為芽孢桿菌蛋白酶。

3 結(jié)束語

桑葉蛋白作為桑葉提取物，具有原料易得、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。目前，雖然已有多項(xiàng)關(guān)于桑葉蛋白提取方面的研究工作，但僅處于實(shí)驗(yàn)室階段，因此，開發(fā)適合規(guī)模化生產(chǎn)的提取、純化工藝，是未來的發(fā)展方向。同時(shí)，桑葉蛋白中氨基酸種類豐富，借助于已有研究證明桑葉蛋白酶促水解物抗氧化、降血壓的功能，拓展桑葉蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，可將桑葉蛋白應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)，提高其附加值。這對(duì)于充分利用我國(guó)的桑葉資源、提高桑農(nóng)收入等都具有重大的意義。