養蝦池中1株副溶血弧菌的分離和鑒定

崔瑋琪

(濱州市海洋發展研究院，山東濱州 256600)

弧菌(Vibrio)是海水養殖中比較常見的致病菌之一，發病率高，危害性較大，尤其是對蝦育苗期，感染后會出現大量死亡的現象[1，2]。有研究發現，副溶血性弧菌是導致對蝦急性肝胰腺壞死病(Ahpnd)的主要病原體，被感染后的對蝦會出現生長緩慢、運動無力、中腸及肝胰腺蒼腺蒼白等癥狀[3-6]，因此弧菌嚴重制約這對蝦產業的發展。文章從患病的凡納濱對蝦養殖池的水樣中分離出病原菌株并對菌株進行鑒定，以期為對蝦養殖中疫病防控研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗水樣

試驗水樣來自濱州市博興縣某育苗廠的4個健康無病害的凡納濱對蝦的養殖池，每個池塘內選取了5個不同采樣點，每個采樣點取20mL水樣，將所有水樣混合均勻。

1.2 菌株分離、純化

1.2.1 初篩

在超凈工作臺內，取混合后的水樣100uL均勻涂布于TCBS固體瓊脂培養基上，28℃倒置培養24 hrs[7]，觀察菌落形態。將培養出的細菌進行劃線純化，再挑取單菌落接種到TSB培養基，過夜培養[8]。

1.2.2 菌株的生理生化鑒定

形態特征：挑取TCBS培養基上的藍綠色單菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態特征。

生化鑒定：主要包括葡萄糖發酵、甘露醇發酵、蔗糖發酵、阿拉伯糖發酵、鼠李糖發酵、4℃生長、42℃生長、氧化酶、蔗糖發酵、接觸酶、葡萄糖產氣、0% NaCl生長、2%NaCl生長、5%NaCl生長、7% NaCl生長、10% NaCl生長、吲哚產生、V.P.反應、甲基紅。

參照《常見細菌鑒定手冊》[9]和《伯杰氏鑒定細菌手冊》判斷細菌種類。

1.2.3 16S rDNA基因序列分析

采用TaKaRa試劑公司的DNA提取試劑盒提取單組菌落DNA，將提取得到的DNA進行PCR擴增。PCR擴增反應條件：95℃時5mins，94℃時1min，55℃時1min，72℃時90s。總計進行35個循環，最后72℃時10mins。產物經1%瓊脂凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(濟南)股份有限公司測序。應用BLAST軟件將所得到的序列與GenBank中有關序列進行同源性分析，選取同源性高的序列，利用Mega 5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.4 生長曲線的測定

將篩選得到的菌種進行37℃液體搖床培養，從接種開始每隔2hrs取樣一次，在560nm下測定菌液的OD值。繪制OD值和培養時間的關系圖。

2 浸染試驗

2.1 攻毒實驗對象及條件

采用濱州市某養殖場體長約3cm左右的健康的凡納濱為試驗對象，正式試驗開始前，將凡納濱對蝦放在pH8.0，連續充氣塑料桶內暫養4d，配合飼料飽食投喂。養殖水體鹽度為19‰，水溫為26℃，隨后將凡納濱對蝦隨機分組，每組為30尾。在浸染試驗前所有試驗組對蝦需禁食1d。

2.2 供試菌株

將純化后的菌株接種到2216E液體培養基上，28℃搖床培養20hrs，560nm(OD 560nm)比濁測定后備用。

2.3 浸浴攻毒實驗

試驗共設立5個處理組和一個對照組。將活化的ZH-1菌液 [104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL和108cfu/mL] 300mL分別加入20L的水體中，浸泡30尾試驗的凡納濱對蝦，同時設同體積的無菌生理鹽水作為實驗對照，每組設置3個平行。每天觀察凡納濱對蝦的發病與死亡情況，實驗周期為7d。

3 實驗結果

3.1 病原菌的分離

從來自不同苗池的3株菌株，選擇其中1株進行后續試驗，編號為ZH-1。

3.2 病原菌的鑒定

3.2.1 鏡檢

ZH-1經革蘭氏染色鏡檢觀察為陰性菌，形狀為短桿狀、兩端鈍圓，分散排列，邊緣圓形，略微隆起，渾濁，呈綠色，在2216E培養基上菌落呈擴展狀，大小不規則，不透明，濕潤，淺綠色。

3.2.2 生化試驗

對分離株做生化試驗結果如表1所示。

表1 ZH-1的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characterization of ZH-1 strain

3.3 16S rDNA測定

采用16S rDNA測定后，獲得圖1結果：

圖1 病原菌16S rDNA基因序列

圖2 基于16S rDNA基因構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

3.4 分離株生長曲線的測定

如圖3所示，菌株ZH-1在培養6hrs的時候開始進入了對數生長期，在22hrs時達到了對數期的最高值，隨后進入了穩定期，28hrs后開始進入衰亡期。

圖3 ZH-1的生長曲線Fig.3 the growth curve of ZH-1

3.5 凡納濱對蝦浸染攻毒試驗結果

取健康的凡納濱對蝦，驗證菌株ZH-1的致病性。試驗結果表明：濃度分別為1.0×104cfu/mL、1.0×105cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×107cfu/mL、1.0×108cfu/mL時，浸浴4d后死亡率分別為100%、76.7%、40.0%、6.67%，而對照組沒有出現死亡現象。經過計算菌株ZH-1對凡納濱對蝦的半數致死濃度為1.12×106cfu/mL。

表2 菌株ZH-1對凡納濱對蝦人工浸浴感染半致死試驗Tab.2 LC50 test of pathogenic strian ZH-1 against Litopenaeus vannamei

4 討論

副溶血弧菌是水產養殖病害的主要病原菌，是急性肝胰腺壞死病的主要病原體，感染后的對蝦會出現生長緩慢、乏力、肝胰腺及腸發白等癥狀[4，5，9]。樊景鳳、張曉君等報道過凡納濱對蝦被副溶血弧菌感染后會出現紅體的現象，該研究中使用菌株ZH-1感染凡納濱對蝦后不僅出現附肢發紅，肝胰腺出現腫大。人工浸浴感染實驗證明菌株ZH-1感染性較強，菌株濃度在1.0×107cfu/mL時會造成76.7%的對蝦死亡。

近年來，弧菌作為對凡納濱對蝦養殖場的危害出現了逐年嚴重的趨勢，因此養殖戶要引起足夠的重視，提高防控意識。一要保證做每次進水需要消毒，為對蝦生長提供良好的水環境；二要做到及時跟蹤監測養殖池內的水質環境，防止弧菌的大量繁殖和傳播；三要定時監測水體和蝦體內弧菌情況；三是可以投喂一些益生菌，例如乳酸菌、酵母菌等，在腸道內形成優勢菌群，抑制腸道內弧菌的繁殖。