饑餓對日本囊對蝦免疫及ATP酶活性的影響

趙思哲，李婉瑩，李永闖，于淼淼，賴曉芳,2,3，王攀攀,2,3，于 飛，閻斌倫,2,3，吳 君，何孝鋒，高 煥,2,3

( 1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院，江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222005； 3.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014； 4.連云港市海洋與漁業發展促進中心，江蘇 連云港，222005； 5.連云港市啟明水產有限公司，江蘇 連云港，222005; 6.江蘇孝豐農業科技集團有限公司，江蘇 鹽城 224000 )

不利環境導致的脅迫現象對水生生物而言是經常發生的，此時它們會通過調節自身的生命活動及各種酶的活性來應對環境脅迫[1-4]。在所有的環境脅迫中，饑餓是水生生物最容易受到的脅迫因子之一。一般而言，當饑餓脅迫發生時，水生生物的消化能力會隨著饑餓時間的延長而變化，主要表現在其消化組織中一些酶的活性會發生改變[5]，同時消化器官的組織結構及功能也會受到損傷[6]。不僅如此，饑餓脅迫也會影響水生生物的免疫功能，導致代謝能力下降、抗氧化能力降低[7]等現象的發生。饑餓脅迫對甲殼類動物行為學影響方面的研究也有所報道，如在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中的研究表明，仔蝦在饑餓前期尋食行為顯著增強，隨著饑餓時間的延長其活動行為明顯降低[8-9]。但在饑餓脅迫下，甲殼類動物的生長、免疫和能量代謝方面的變化特征研究還較少。

日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)屬節肢動物門甲殼綱十足目對蝦科囊對蝦屬[10]，因其營養豐富、肉質鮮美，且易活體運輸等優點，一直以來都是我國重要的海水養殖對象之一。目前，關于日本囊對蝦在饑餓條件下的生長[11]、攝食[12]、代謝[13]及性腺發育[14]等方面的研究已經有所報道，但對于饑餓脅迫下不同組織的免疫功能和能量代謝相關酶活性變化的特征還缺少系統的分析。筆者以日本囊對蝦為研究對象，探究饑餓脅迫對其不同組織(肝胰腺、胃和腸道)免疫相關酶及ATP酶活性的影響，為進一步優化日本囊對蝦的科學、健康的養殖模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用日本囊對蝦由江蘇省連云港贛榆佳信水產開發有限公司提供，平均體質量(0.8±0.06) g，平均體長(4.7±0.2) cm。隨機挑選健康、活力好的個體于1000 L養殖桶中暫養，暫養期間溫度為25 ℃，鹽度為28，pH為8，持續充氧。暫養期間日換水1/3，投喂2次(8:00和19:00)商品顆粒飼料(粗蛋白≥49.01%、粗脂肪≥7.24%)，每日投喂量為蝦體質量的5%。投喂后1 h底部吸污。

1.2 饑餓脅迫試驗

暫養3 d后選取體格健全、活力好的日本囊對蝦，平均投放到9個60 L(50 cm×40 cm×30 cm)養殖箱中，每個養殖箱中放20尾。環境條件與暫養條件一致。為防止個體間殘食，筆者設計了1種多層多格的格柵式養殖裝置，每格放置1尾個體，在每層養殖格柵上鋪設隔板。分別在饑餓0、3、6、9、12 d時取樣，其中0 d設置為對照組，其余時間點為試驗組。每次隨機取9尾蝦，每個養殖箱取1尾，用吸水紙吸干體表水分，測量蝦的體長、體質量。取樣時用手術刀切開頭胸甲的外殼，挑取胃和肝胰臟組織，從尾寬處切取約0.2 g肌肉組織，每3尾蝦的各個組織做成1個混樣進行樣品制備。將不同組織分別置于1.5 mL的離心管中，稱量質量后先用液氮進行預冷后轉置-80 ℃冰箱保存。

1.3 樣品制備

向準確稱量質量后的組織樣品中按1 g∶9 mL的比例添加提前預冷的0.9%生理鹽水，之后在冰浴中研磨5 min，將得到的研磨液4 ℃、2500 r/min離心(離心半徑5.8 cm)10 min后吸取上清液，置于冰箱中-80 ℃保存待用。

1.4 酶活性測定

各組織的酶活性測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，測定項目包括胃、肝胰腺、肌肉3種組織中的總蛋白含量及堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)、鈣鎂ATP酶(Ca2+-Mg2+-ATPase)活性，具體檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.5 數據處理

日本囊對蝦的生長評定指標選擇肥滿度。計算公式如下：

式中，CF是肥滿度，mt是各取樣時間點時日本囊對蝦的平均體質量(g)，Lt是各取樣時間點日本囊對蝦的平均體長(cm)。

利用Excel和SPSS 26.0進行統計分析。對試驗數據進行單因素方差分析，若各處理組數據具有顯著性差異，再采用鄧肯多重比較檢驗均值對各組數據的差異性，顯著水平標準為0.05，試驗數據采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 饑餓脅迫對日本囊對蝦生長性能的影響

饑餓脅迫對日本囊對蝦生長性能的影響見圖1。在饑餓條件下，日本囊對蝦體質量隨脅迫時間呈下降趨勢，除第3天外其他試驗組數據與對照組相比均差異顯著(P<0.05)，且從第6天開始下降趨勢更為明顯。日本囊對蝦肥滿度的變化趨勢同體質量一致，這表明饑餓脅迫顯著降低了日本囊對蝦的生長性能(P<0.05)。

圖1 饑餓脅迫對日本囊對蝦生長性能的影響

2.2 饑餓脅迫對日本囊對蝦各組織免疫相關酶活性的影響

饑餓脅迫對日本囊對蝦免疫相關酶活性的影響見圖2。在胃組織中，隨著饑餓時間的延長，過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性呈現先升后降的趨勢，且在第3天酶活性達到最高值。過氧化氫酶活性除第6天外，其他各組與對照組之間差異顯著(P<0.05)；除第3、6天外，各組間超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)。酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性均隨著脅迫時間的延長呈現下降趨勢，且各試驗組酶活性均與對照組之間差異顯著(P<0.05)。在肝胰腺組織中，過氧化氫酶活性先升后降，且在第3天達到最高值并與對照組差異顯著(P<0.05)；酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性均隨著脅迫時間的延長持續下降，在第12天降至最低，其中堿性磷酸酶活性下降幅度最大；各試驗組酶活性與對照組差異顯著(P<0.05)。在肌肉組織中，各免疫相關酶活性的變化情況與肝胰腺組織相類似，除過氧化氫酶外，各種酶活性均隨著脅迫時間的延長呈現下降的趨勢，其中堿性磷酸酶的變化幅度最小；過氧化氫酶活性在第3天達到最高值，隨后顯著下降(P<0.05)。

圖2 饑餓脅迫對日本囊對蝦免疫相關酶活性的影響

2.3 饑餓脅迫對日本囊對蝦ATP酶活性的影響

饑餓脅迫對日本囊對蝦ATP酶活性的影響見圖3。在所有組織中，鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均隨著脅迫時間的延長呈現先升后降的趨勢。

圖3 饑餓脅迫對日本囊對蝦ATP酶活性的影響

在胃組織中，鈉鉀ATP酶活性在第6天達到最高值；鈣鎂ATP酶活性在第3天達到最高并與其他各組差異顯著(P<0.05)。在肝胰腺組織中，鈉鉀ATP酶活性相較于其他組織變化幅度最大；鈣鎂ATP酶活性在第3天達到最高后開始顯著下降(P<0.05)，并在第12天達到最低值，與對照組間差異不顯著(P>0.05)。在肌肉組織中，試驗組鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性與對照組間均差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 饑餓脅迫對日本囊對蝦生長性能影響

饑餓會嚴重影響水生動物的生長性能。在魚類中，饑餓脅迫會使魚體肥滿度、肝體指數及性腺指數顯著降低(P<0.05)[15]，還會對生殖系統造成損傷[16-17]。在蝦類中的研究結果也與之相類似。莫桑比克草蝦(Penaeusmonodonmozambique)在饑餓脅迫下體質量顯著降低，同時肌肉中粗脂肪和粗蛋白的含量也顯著降低[18]。本試驗結果顯示，饑餓對日本囊對蝦生長發育具有顯著的影響，其體質量和肥滿度隨著脅迫時間延長而顯著下降(P<0.05)，這是由于日本囊對蝦在饑餓前期利用體內儲存的蛋白質和脂肪聯合供能，而在后期則全部由蛋白質提供能量[13]，消耗體內儲存的能量來維持生理活動導致了生長性能的降低。該結論與對凡納濱對蝦的研究結果[19]類似。

3.2 饑餓脅迫對日本囊對蝦免疫相關酶活性的影響

過氧化氫酶是一種末端氧化酶，在自然界中廣泛分布在動植物及微生物體內，在生物防御系統里擔任著重要的角色。過氧化氫酶可以清除生物體內過量的過氧化氫，并將其分解為水和氧氣，防止細胞發生病變。在動物體內，過氧化氫酶還可以降低細胞中的應激反應，在宿主受到外界的刺激或脅迫時起到抵御和保護的作用[20]。本試驗結果表明，隨著饑餓時間的延長，日本囊對蝦的胃、肝胰腺、肌肉組織中過氧化氫酶活性呈現先升后降的趨勢，這與口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)在饑餓脅迫下的表現[21]一致。在饑餓條件下，由于受到外界環境脅迫，機體會產生大量的自由基，此時過氧化氫酶在被誘導的情況下上調活性以維持機體的穩定，因此在饑餓第3天酶活性達到最高值，肝胰腺作為機體免疫的重要組織器官，其酶活性上調最為顯著；隨著脅迫時間的推移，此時機體已難以承受外界環境的脅迫，日本囊對蝦各組織的抗氧化系統已經造成一定的損傷，還原自由基的能力下降，代謝紊亂，導致機體免疫能力下降，酶的活性也呈現顯著下降的趨勢。這與中華鰲絨蟹(Eriocheirsinensis)在饑餓狀態下的表現一致[22]。

堿性磷酸酶是一種常見的非特異性磷酸酯酶，其主要任務是通過調節機體的新陳代謝，參與磷酸基團的轉移和代謝活動，同時參與營養物質的消化吸收，維持生命活動需要[23-24]。當機體處于脅迫狀態下，堿性磷酸酶活性會隨之發生一定的變化以幫助機體適應環境[25]。本試驗結果表明，在饑餓脅迫下，日本囊對蝦胃、肝胰腺、肌肉組織中的堿性磷酸酶活性隨著時間延長呈下降趨勢，這表示隨著饑餓時間的增加，日本囊對蝦的免疫能力下降，體內堿性磷酸酶活性受到抑制，尤其是在肝胰腺組織中，酶活性下降趨勢與其他兩個組織相比極為顯著。相同的結果在口蝦蛄、仿刺參(Apostichopusjaponicus)中也有報道[26]。酸性磷酸酶同堿性磷酸酶，可以在生物活動中調節磷酸基團的轉移和代謝，是一種重要的水解酶。本試驗中，饑餓脅迫對日本囊對蝦胃、肝胰腺、肌肉組織中的酸性磷酸酶活性的影響非常顯著，并且隨著時間的延長均呈下降的趨勢，與堿性磷酸酶的變化趨勢一致。在饑餓狀態下，機體會消耗自身能量導致免疫功能下降，這也是酸性磷酸酶活性會隨饑餓時間延長而下降的原因[27]。

超氧化物歧化酶是一種穩定性很高的酸性蛋白，在細胞和組織中承擔著清除超氧化陰離子自由基的角色，對降低機體氧化損傷有至關重要的作用[28]。當機體處于脅迫狀態時，體內的免疫細胞會產生自由基物質來清除外來入侵物；但當免疫反應過度時，這種非特異性免疫反應會無法分辨“敵我”，對蛋白質、核酸、脂肪等生命基本分子進行攻擊，造成機體損傷[29-30]。在同一對象的不同組織中超氧化物歧化酶的含量也會不一致，在一般情況下肝臟部位的含量最高，這也與本試驗結果一致。本試驗結果表明，日本囊對蝦胃組織中的超氧化物歧化酶活性隨著脅迫時間的延長呈現先升后降的變化趨勢，并在饑餓第3天達到最高值，這有可能是因為：機體受到饑餓脅迫時免疫系統自動開啟來應對脅迫，酶活性增強；隨著脅迫時間的延長，機體免疫能力已無法和外界脅迫相平衡，機體的能量也被消耗殆盡，酶活性下降。而在肝胰腺、肌肉組織中的超氧化物歧化酶活性隨著饑餓脅迫時間的延長表現為下降的趨勢，這有可能是由組織特異性所致。

3.3 饑餓脅迫對日本囊對蝦鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性影響

鈉鉀ATP酶與鈣鎂ATP酶都是存在于細胞膜內的蛋白，其作用是物質運輸、能量轉換及信息傳遞等，它們是反映機體生長狀況、滲透調節和生理代謝的重要指標。鈉鉀ATP酶能催化三磷酸腺苷的水解從而提供能量，使位于細胞膜兩側的鈉離子、鉀離子進行對向運輸，對于機體調節細胞滲透壓和離子平衡的生理活動有重要的調節作用[31-32]；鈣鎂ATP酶能夠影響肌肉的收縮、神經細胞動作電位的傳導、細胞的分泌和繁殖。本試驗結果表明，隨著脅迫時間的延長，日本囊對蝦各組織中鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均呈先升后降的趨勢，這可能是因為：在饑餓脅迫下，機體調動儲存在體內的糖原、蛋白質、脂質等物質來為自身供能以維持生命，此時線粒體供能需求增加，酶的活性經誘導后發生上調；在饑餓脅迫后期，一方面儲存的供能物質被消耗殆盡，另一方面機體免疫系統遭受到破壞，產生的自由基極易使ATP酶中富含的賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸等發生修飾反應，使其結構發生變化，降低酶活性；同時饑餓脅迫后期脂質過氧化使細胞膜發生損傷，破壞膜的完整性和流動性，酶活性也隨之下降。

4 結 論

綜上所述，饑餓脅迫會對日本囊對蝦的生長、免疫及能量代謝能力產生顯著影響，并且在胃、肝胰腺、肌肉組織中不同的酶活性會因組織特異性呈相同或不同的變化趨勢。筆者對日本囊對蝦饑餓逆境的調節機制的研究結果，可為今后在養殖過程中制定更科學、更適量地投喂模式與策略提供一些先行的理論基礎，以期提高日本囊對蝦的養殖存活率和養殖產量，并為進一步優化日本囊對蝦的養殖模式提供參考。