基于高通量測(cè)序的長(zhǎng)江口中華絨螯蟹雌蟹食性分析

徐靜靜，馮廣朋，張 濤，耿 智，楊 剛，宋 超，李春波

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海長(zhǎng)江口漁業(yè)資源增殖和生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，上海 200090； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306 )

長(zhǎng)江口海陸交匯，生境獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極其豐富，為水生生物提供了充足的餌料基礎(chǔ)。營(yíng)養(yǎng)相互作用機(jī)制是生態(tài)學(xué)中的一個(gè)基本問(wèn)題，倍受生物學(xué)研究者的關(guān)注，其研究結(jié)果能為動(dòng)物生態(tài)習(xí)性解析、物種進(jìn)化分析及生物資源保護(hù)提供參考依據(jù)[1]。傳統(tǒng)水生動(dòng)物食性分析方法主要依賴胃腸食物中未被完全消化的組織器官的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，然而鑒定過(guò)程中常會(huì)遇到因食物僅剩微小顆粒而導(dǎo)致種類難以分辨確認(rèn)的問(wèn)題。

目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量技術(shù)逐漸得到應(yīng)用，并被擴(kuò)展到水生生物食性分析領(lǐng)域。相比于傳統(tǒng)的食性形態(tài)學(xué)分析方法，高通量技術(shù)具有檢測(cè)靈敏(能捕獲頻次較低的DNA序列)、樣本量少、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)將測(cè)序結(jié)果與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可將食物的分類精確到種一級(jí)分類單元。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用高通量測(cè)序技術(shù)在食性分析研究方面取得了較好進(jìn)展，對(duì)食肉動(dòng)物豹貓(Prionailurusbengalensis)[2]、褐家鼠(Rattusnorvegicus)[3]、奧地利滑蛇(Coronellaaustriaca)[4]等食性進(jìn)行了研究。高通量技術(shù)還被用于海洋生物的食性分析，如Leray等[5]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了3種魚(yú)的食物組成，檢測(cè)到292個(gè)運(yùn)算分類單元(OTU)，其中51%的單元可鑒定到種水平，另外26%的單元可鑒定到屬水平。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域，屬洄游性甲殼類動(dòng)物，成蟹性腺發(fā)育至Ⅳ期后由淡水棲息地向長(zhǎng)江河口咸淡水區(qū)進(jìn)行生殖洄游。繁殖期作為中華絨螯蟹生活史最重要的生命階段，是決定其種群資源量的關(guān)鍵階段。餌料攝食是影響其繁殖的重要因素之一，是生態(tài)學(xué)研究的主要焦點(diǎn)之一。對(duì)于中華絨螯蟹食性已有較多研究，如：Rudnick等[6]對(duì)中華絨螯蟹生活史不同階段食性進(jìn)行了研究，指出中華絨螯蟹在溞狀幼體和大眼幼體階段主要攝食浮游植物與浮游動(dòng)物，在幼蟹階段主要攝食水生植物，二齡成蟹食性為偏肉食性的雜食性，在天然水域中主要攝食水生植物、附著藻類、小雜魚(yú)、蝦類、貝類、水生昆蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)[7-9]；胃含物形態(tài)學(xué)食性分析表明，繁殖期中華絨螯蟹雌蟹抱卵前后的餌料組成復(fù)雜，包括水生植物、藻類、甲殼類、多毛類、魚(yú)類、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、卵、顆粒碎屑等種類[10-11]。從長(zhǎng)江口采集的中華絨螯蟹雌蟹樣品，由于腸胃內(nèi)食物消化程度較高，應(yīng)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法研究其食性仍存在一定的困難和不足。因此，筆者通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江中華絨螯蟹雌蟹的食性進(jìn)行對(duì)比研究，以期揭示生殖洄游期中華絨螯蟹雌蟹的食物種類組成，掌握雌蟹在抱卵前后的食性變化特征，為長(zhǎng)江口中華絨螯蟹棲息地修復(fù)和資源增殖保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，并探討高通量技術(shù)在水生生物食性分析中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

利用單船桁桿底拖網(wǎng)在長(zhǎng)江口東灘水域(E 122°4′～122°11′、N 31°20′～31°25′)采集生殖洄游期中華絨螯蟹雌蟹，其中，抱卵前雌蟹采樣時(shí)間為2017年11月，抱卵后雌蟹采樣時(shí)間為2018年2—4月。隨機(jī)選取規(guī)格相似、活力較強(qiáng)的抱卵前雌蟹20只和抱卵后雌蟹17只作為試驗(yàn)樣本。試驗(yàn)樣本用75%乙醇進(jìn)行體表消毒后，在超凈工作臺(tái)上解剖取出腸道，-80 ℃保存待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

提取抱卵前后的雌蟹DNA，稀釋后的基因組DNA使用帶Barcode特異性引物18S V4區(qū): 528F(GCGGTAATTCCAGCTCCAA)-706R(AATCCRAGAATTTCACCTCT)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。根據(jù)PCR濃度進(jìn)行等質(zhì)量混樣，使用1×TAE的2%瓊脂糖凝膠電泳純化充分混勻后的PCR產(chǎn)物，割膠回收目標(biāo)條帶。使用Thermo Scientific公司GeneJET試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化。使用Thermo Fisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)經(jīng)Qubit定量并檢測(cè)合格后，使用Thermo Fisher的IonS5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)集中于末端的分布特點(diǎn)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。根據(jù)Barcode將序列按樣品拆分，并去除Barcode；利用Trimmomatic軟件對(duì)雙端序列分別去除：去除尾部質(zhì)量值低于25 bp的堿基；同時(shí)設(shè)置50 bp滑動(dòng)窗口，1 bp步移，窗口內(nèi)堿基平均質(zhì)量不低于25 bp；最后去除長(zhǎng)度低于100 bp的序列；利用Flash軟件將高質(zhì)量雙端序列進(jìn)行連接，最小overlap區(qū)10 bp，最大錯(cuò)配率0.2，去除含模糊堿基N的序列。

按照序列相似性97%聚類后取豐度最高的1條序列作為1個(gè)運(yùn)算分類單元。分析使用Uparse軟件(Edgar，2013)得到相應(yīng)的運(yùn)算分類單元豐度表。注釋分析通過(guò)GenBank庫(kù)對(duì)分類信息進(jìn)行注釋。將GenBank庫(kù)得到的非餌料信息(主要是一些真菌類生物)手動(dòng)去除，利用SPSS 22.0軟件對(duì)注釋到的餌料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Mothur軟件(Schloss，2009)繪制Shannon曲線用以檢測(cè)樣品數(shù)據(jù)量的合理化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物條帶

PCR產(chǎn)物目的條帶大小為400～450 bp，總量滿足2次或者2次以上建庫(kù)需要，可進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)(圖1)。

圖1 中華絨螯蟹雌蟹腸含物PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 高通量測(cè)序序列

長(zhǎng)江口中華絨螯蟹雌蟹37個(gè)樣本的高通量測(cè)序統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1，測(cè)序總序列為56 856～93 305個(gè)，用于分類的序列為53 288～90 598個(gè)。樣本的稀釋曲線見(jiàn)圖2，在97%相似性為閾值的條件下，測(cè)序的數(shù)據(jù)量可以達(dá)到樣品物種多樣性評(píng)估的要求。

圖2 不同樣品組稀釋曲線

表1 測(cè)序結(jié)果

37個(gè)樣品通過(guò)聚類分析共得到423個(gè)運(yùn)算分類單元，通過(guò)GenBank庫(kù)BLAST比對(duì)，注釋得到雌蟹的餌料組成。手動(dòng)去除注釋結(jié)果中非真核生物信息，通過(guò)GenBank庫(kù)比對(duì)出來(lái)的餌料種類包括：硅藻門(mén)、綠藻門(mén)、甲藻門(mén)、金藻門(mén)、紅藻門(mén)、高等植物、魚(yú)類、甲殼類、浮游動(dòng)物、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物等(表2)。

表2 餌料種類分析結(jié)果(運(yùn)算分類單元比對(duì)的餌料種類)

2.3 抱卵前后餌料組成的多樣性

雌蟹抱卵前后鑒定的物種數(shù)量表明，抱卵前雌蟹的餌料組成物種數(shù)量大于抱卵后(表3)。抱卵前后的多樣性指數(shù)如Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，豐富度指數(shù)如Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)抱卵前顯著大于抱卵后(P<0.05)。

表3 不同組別物種數(shù)和多樣性指數(shù)

門(mén)水平上數(shù)量分析表明：雌蟹抱卵前食物種類占比較高的餌料為高等植物、節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、魚(yú)類、硅藻門(mén)和甲藻門(mén)，占比分別為57.92%、16.18%、9.09%、7.23%和3.91%；抱卵后食物種類較高的餌料為高等植物、硅藻門(mén)、甲藻門(mén)和節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，占比分別為43.96%、20.91%、13.51%和9.34%(圖3)。

圖3 雌蟹抱卵前后門(mén)水平上主要餌料種類

屬和種水平上數(shù)量分析表明，雌蟹抱卵前食物組成中占比較高的餌料為蘆葦、中肋骨條藻、金魚(yú)藻、安氏白蝦、鳳眼蓮、橈足綱和，占比分別為29.31%、10.53%、8.9%、5.68%、5.90%和5.13%；抱卵后雌蟹食物組成中占比較高的餌料為蘆葦、中肋骨條藻、甲藻門(mén)、金魚(yú)藻和海鏈藻屬，占比分別為39.56%、16.99%、9.51%、8.53%和6.56%(圖4)。

圖4 雌蟹抱卵前后屬和種水平上的餌料種類

屬和種水平上餌料種類橈足類、秀麗織紋螺、安氏白蝦、斑尾刺蝦虎魚(yú)和的百分比抱卵前大于抱卵后；而蘆葦、中肋骨條藻、互花米草、海鏈藻屬和甲藻門(mén)的百分比抱卵后大于抱卵前(圖5、圖6)。

圖5 雌蟹抱卵前后門(mén)水平上餌料類型的差異性

圖6 雌蟹抱卵前后屬水平上的差異性

藻類、高等植物、動(dòng)物性餌料在雌蟹抱卵前占比分別為14.72%、57.92%和27.70%；在抱卵后食物組成中占比分別為42.40%、43.96%和13.85%。雌蟹抱卵前傾向喜好動(dòng)物性餌料，抱卵后傾向喜好植物性餌料(圖7)。

圖7 雌蟹抱卵前后的餌料選擇性

2.4 抱卵前后食物組成中的優(yōu)勢(shì)種類

蘆葦和中肋骨條藻是生殖洄游期中華絨螯蟹的優(yōu)勢(shì)餌料，抱卵前占比分別為29.31%和10.53%；抱卵后占比分別為39.56%和16.99%(圖8)。

圖8 雌蟹抱卵前后的優(yōu)勢(shì)餌料

3 討 論

3.1 長(zhǎng)江口中華絨螯蟹的餌料組成

高通量測(cè)序方法分析表明，長(zhǎng)江口生殖洄游期中華絨螯蟹雌蟹的餌料種類主要為硅藻、綠藻、甲藻、金藻、紅藻、高等植物、魚(yú)類、節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、浮游動(dòng)物、原生動(dòng)物等，這與中華絨螯蟹屬于雜食性動(dòng)物的結(jié)果基本一致。關(guān)于中華絨螯蟹的食性，已有的研究結(jié)果表明，植物性餌料主要為菹草(Potamogetoncrispus)、苦草(Vallisneriaspiralis)、金魚(yú)藻、馬來(lái)眼子菜(P.malaianus)、黃絲草(P.maackianus)、黑藻(Hydrillaverticillata)等[9,11]。基于高通量技術(shù)的食物組成研究結(jié)果與已有的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)食性分析結(jié)果存在一定差異，主要是食物組成中的魚(yú)類部分差異較大。藻類的鑒定結(jié)果與胃含物分析結(jié)果基本保持一致，硅藻為優(yōu)勢(shì)藻類，其中以中肋骨條藻、瓊氏圓篩藻、舟形藻數(shù)量最多，這可能與長(zhǎng)江口冬季優(yōu)勢(shì)藻類為中肋骨條藻和圓篩藻有關(guān)[12]。蘆葦、海三棱藨草、互花米草、金魚(yú)藻、鳳眼蓮等被高通量測(cè)序技術(shù)鑒定出的高等植物食物，與長(zhǎng)江口島嶼濕地的自然植物資源組成一致[13]。秀麗織紋螺、安氏白蝦、瓣鰓類、橈足綱、中華華哲水蚤等被高通量測(cè)序技術(shù)鑒定出的食物種類，在相關(guān)研究中亦有類似結(jié)果[10-11]。然而，高通量測(cè)序鑒定出了、斑尾刺蝦虎魚(yú)等魚(yú)類，但中華絨螯蟹活動(dòng)較慢，難以直接攝食這些游動(dòng)較快的魚(yú)類[6]，因此，這些魚(yú)類的出現(xiàn)，可能是其水體中尸體被中華絨螯蟹攝食的結(jié)果。在餌料鑒定的結(jié)果中，抱卵前雌蟹中還檢測(cè)到江氏偽鐘蟲(chóng)(Pseudovorticellajiangi)寄生蟲(chóng)的存在，這與耿智等[14]研究發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)江口中華絨螯蟹存在寄生蟲(chóng)的研究結(jié)果相符合。

3.2 雌蟹抱卵前后餌料的差異性

高等植物是雌蟹抱卵前后食物組成中占比最多的種類，餌料占比分別為57.92%和43.96%。其中，高等植物中蘆葦占比最高，這不僅與蘆葦是長(zhǎng)江口最主要的植被類型，其本身具有很強(qiáng)的適應(yīng)酸堿變化的能力有關(guān)[15]，還與中華絨螯蟹喜食有關(guān)[16]，與景麗[17]的研究結(jié)果——中華絨螯蟹對(duì)水生維管束植物蘆葦?shù)臄z食率最高一致。本研究結(jié)果表明，中華絨螯蟹雌蟹動(dòng)物性餌料占比在抱卵前大于抱卵后，原因是：抱卵前雌蟹長(zhǎng)江口水溫較高，活力更強(qiáng)，可以攝食更多的餌料種類，滿足其性腺發(fā)育和交配產(chǎn)卵等繁殖能量支出需求[18]；相對(duì)來(lái)說(shuō)，抱卵后雌蟹的攝食能力減弱[6]，導(dǎo)致其攝食餌料種類亦相應(yīng)減少；另一方面，抱卵前長(zhǎng)江水域浮游生物等餌料種類更豐富，密度更高，從而抱卵前雌蟹能攝食獲取更多的動(dòng)物性餌料，致使動(dòng)物性餌料的占比更高。這與長(zhǎng)江口水域潛在餌料組成與密度的季節(jié)變化規(guī)律一致[19]。

3.3 高通量測(cè)序與胃含物分析結(jié)果的差異性

胃含物分析食性研究的應(yīng)用方向主要為5個(gè)，即研究生物的攝食組成、攝食行為/選擇、攝食強(qiáng)度、生態(tài)轉(zhuǎn)換效率和生態(tài)位[20]。高通量測(cè)序分析結(jié)果表明，雌蟹抱卵前主要餌料為高等植物、甲殼動(dòng)物和魚(yú)類，抱卵后主要餌料為高等植物和藻類；而胃含物分析結(jié)果是抱卵前后的雌蟹餌料組成以藻類和碎屑為主。兩者之間具有一定差異性，主要是由兩種鑒定技術(shù)方法的特點(diǎn)不同所致。一方面，胃含物中存在的不可分辨物和顆粒碎屑可能是植物和動(dòng)物經(jīng)消化和分解形成的，形態(tài)學(xué)方法難以鑒定，而在高通量測(cè)序中可以被鑒定出，所以高等植物和動(dòng)物性餌料占比增大；另一方面，胃含物法分析對(duì)象主要為胃內(nèi)含物，而高通量分析對(duì)象主要為腸容物，藻類易消化吸收，當(dāng)食物殘?jiān)竭_(dá)腸道時(shí)藻類已被大部分消化，造成高通量研究結(jié)果中藻類占比減少。因此，通過(guò)高通量測(cè)序方法研究分析水生動(dòng)物的食物組成，在一定范圍內(nèi)是一種既高效又精確的研究方法[21]，這種方法可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)基于顯微鏡下檢查看不見(jiàn)的餌料生物；如果參考數(shù)據(jù)庫(kù)是全面的，還可以鑒定出比胃含物分析法更精確的餌料分類水平[22]。

雖然高通量測(cè)序數(shù)據(jù)量大[23]，能夠以更高的檢出率鑒別餌料，但是與胃含物分析法相比，也存在一些不足之處：一是高通量測(cè)序技術(shù)無(wú)法辨別餌料生物的不同生命階段。因?yàn)椴徽撚左w階段還是成體階段，其DNA都是相同的。高通量也很難區(qū)分餌料是被直接攝入進(jìn)入腸胃中，還是由于被其他餌料帶入導(dǎo)致被檢出[24]。由于中華絨螯蟹為雜食性動(dòng)物，其攝食進(jìn)入腸胃食物中的內(nèi)容物(即雌蟹餌料組成中動(dòng)物所攝食的食物種類)會(huì)對(duì)高通量測(cè)試結(jié)果造成一定干擾。因此，在應(yīng)用高通量測(cè)試分析食性前，應(yīng)將研究對(duì)象的腸胃內(nèi)容物分離去除，或者根據(jù)參考資料，將食性組成結(jié)果中不可能客觀存在的種類刪除，盡可能降低二次攝食對(duì)結(jié)果的影響。二是高通量測(cè)序技術(shù)往往無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分食物種類組成的比例。如在食物組成中，種類占比很小的食物可能其攝食量很高，導(dǎo)致比例數(shù)值失真。但對(duì)于本試驗(yàn)而言，主要是針對(duì)雌蟹抱卵前后的食物種類組成進(jìn)行比較，通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)果可以獲得食物組成變化的特征信息，掌握縱向比較的變化規(guī)律。本試驗(yàn)結(jié)果中還出現(xiàn)了大量中華絨螯蟹自身DNA序列，原因可能是一部分序列來(lái)自其自相殘食的結(jié)果[25]，另外可能是在DNA提取的過(guò)程中，自身基因?qū)υ囼?yàn)結(jié)果的影響，這與Deagle等[26]研究表明廣食性動(dòng)物的胃含物中存在大量宿主DNA相一致。本研究結(jié)果顯示，高通量測(cè)序分析方法可揭示水生動(dòng)物的食物種類組成信息[27-28]，但仍需與傳統(tǒng)的胃含物分析方法相結(jié)合，才能更準(zhǔn)確全面地解析其食性特征。今后隨著科研技術(shù)不斷發(fā)展完善，高通量測(cè)序技術(shù)可以為進(jìn)一步為研究探討魚(yú)類等動(dòng)物的食物組成、食性轉(zhuǎn)變、生物防治、資源分配、物種自身特性[29]等提供技術(shù)支撐，并有望為深入研究捕食性和植食性動(dòng)物的食物網(wǎng)提供理想的平臺(tái)[30-31]。

4 結(jié) 論

通過(guò)高通量測(cè)序方法對(duì)長(zhǎng)江口中華絨螯蟹雌蟹食性的研究表明，主要餌料種類為硅藻、綠藻、甲藻、金藻、紅藻、高等植物、魚(yú)類、甲殼類、軟體動(dòng)物、浮游動(dòng)物、原生動(dòng)物等。抱卵前主要餌料為高等植物(57.92%)、甲殼動(dòng)物(16.18%)和魚(yú)類(9.09%)；抱卵后的主要餌料為高等植物(43.96%)和藻類(42.40%)。高通量測(cè)序分析雌蟹食性的結(jié)果與傳統(tǒng)胃含物分析的結(jié)果具有一定的差異性，主要是因?yàn)椋何负锓ㄈ硬牧蠟槲竷?nèi)餌料，高通量取樣材料為腸容物，藻類易消化吸收，導(dǎo)致高通量結(jié)果中藻類占比減少；另外高通量檢測(cè)方法靈敏度高，導(dǎo)致正在消化過(guò)程中的高等植物和動(dòng)物性餌料亦被檢出，從而占比增大。高通量測(cè)序分析方法可在一定程度上揭示水生動(dòng)物的食物種類組成信息，今后在魚(yú)類食性研究中將具有更廣闊的應(yīng)用前景。