殷雙琴，羅 莉 ，陳 濤,2，梁星河,2，曠田垠，代偉宏,3，梁華平，朱俊宇

1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院戰(zhàn)傷感染與特需藥品研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042； 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員旅17隊(duì)，重慶 400038； 3.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海口 571199

創(chuàng)傷是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題，呈逐年增長趨勢。創(chuàng)傷后第三死亡高峰期的主因是創(chuàng)傷后感染引起的膿毒癥、多器官功能障礙綜合征等并發(fā)癥。雖然臨床上對創(chuàng)傷的防治措施不斷改進(jìn)，但是傷后感染的發(fā)生率及病死率仍然居高不下，已成為阻礙危重癥患者救治成功率的主要瓶頸[1-2]。究其原因，還是對創(chuàng)傷后機(jī)體抗感染免疫防御功能的變化及機(jī)制認(rèn)識不夠深入。

研究證明，創(chuàng)傷后免疫功能紊亂尤其是巨噬細(xì)胞(macrophage,Mφ)功能障礙是導(dǎo)致機(jī)體抗感染能力減弱的主要原因之一[3]，巨噬細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)介導(dǎo)的抗感染應(yīng)答中發(fā)揮主導(dǎo)作用，其雙向性功能改變(炎性介質(zhì)生成增多、吞噬殺菌及抗原提呈能力降低)在引發(fā)創(chuàng)傷后免疫功能紊亂中扮演重要角色[4]。嚴(yán)重創(chuàng)傷不僅可致巨噬細(xì)胞的吞噬、殺菌功能降低，抗原提呈功能減弱，還可改變其活化狀態(tài)、抗原表達(dá)、分泌功能及相關(guān)蛋白酶水平。雖然已證實(shí)創(chuàng)傷可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞上述功能的改變，但其抗感染能力減弱的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，尤其在對病毒、細(xì)菌感染以及干擾素(interferon,IFN)刺激的反應(yīng)性方面還未完全明晰，而且目前學(xué)界缺乏對創(chuàng)傷后巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)譜變化的系統(tǒng)性認(rèn)識。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing，RNA-seq)技術(shù)[5]可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化，通過分析不同因素作用下的基因在RNA水平表達(dá)的差異，可以將顯著差異表達(dá)的基因與某些生物學(xué)功能聯(lián)系起來，用于檢測早期變化指標(biāo)和分子調(diào)控機(jī)制的研究。

本研究利用RNA-seq技術(shù)，建立小鼠嚴(yán)重創(chuàng)傷模型并動(dòng)態(tài)提取腹腔巨噬細(xì)胞的RNA，對其進(jìn)行基因功能和信號通路富集分析，深入研究嚴(yán)重創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律，分析差異基因的變化情況，并提出創(chuàng)傷后抗感染能力減弱新的機(jī)制和可能的免疫調(diào)節(jié)干預(yù)靶點(diǎn)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

納入40只雄性6周齡C57BL/6小鼠(SPF級，購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，北京)，體重20～22g，動(dòng)物房室內(nèi)溫度為19～23℃，相對濕度為40%～70% ，采用12h晝夜交替照明方式，小鼠可自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房內(nèi)，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號:SYXK(渝)20170002。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(AMUWEC20211429)。

2 主要試劑

高純總RNA快速提取試劑盒購自百泰克公司，PrimeScript RT reagent Kit試劑盒、SYBR?Prime Ex TaqTMII試劑盒均購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司(TAKARA)，PCR引物由北京擎科生物科技公司合成。紅細(xì)胞裂解液購自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司，氯仿購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

3 動(dòng)物處理與分組

將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、創(chuàng)傷后2h組(TH2h組)、創(chuàng)傷后6h組(TH6h組)、創(chuàng)傷后12h組(TH12h組)，各10只。分別建立小鼠雙下肢股骨骨折+眼球40%失血模型，采取鉗夾雙后肢造成股骨非開放性骨折，同時(shí)復(fù)合眼眶放血30%～40%(全血量由體重的6%計(jì)算)。各組小鼠分別在未創(chuàng)傷和創(chuàng)傷后、2h、6h、12h立即脫頸處死，提取腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

4 腹腔巨噬細(xì)胞總RNA提取

每只小鼠腹腔灌洗5mL冰生理鹽水，提取腹腔灌洗液后300g離心5min，每組加入2mL紅細(xì)胞裂解液后靜置3min，裂解紅細(xì)胞后鋪板，腹腔巨噬細(xì)胞貼壁2h后，棄去培養(yǎng)上清，加入磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入1mL Trizol收集貼壁原代腹腔巨噬細(xì)胞總RNA，按照RNA提取試劑盒步驟提取RNA，檢測RNA的濃度和純度。于-80℃保存，并送往上海美吉生物進(jìn)行RNA-seq。測序數(shù)據(jù)比對小鼠參考基因組(http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index)。

5 差異表達(dá)基因篩選

基于表達(dá)量定量結(jié)果，進(jìn)行組間差異基因分析，獲得兩組間的差異表達(dá)基因，差異分析軟件為：DEGseq，篩選閾值為：|log2FC|≥1 &P<0.01。將對照組vs.TH2h組、對照組vs.TH6h組、對照組vs.TH12h組3組間的差異基因取交集得到3組共有的目標(biāo)差異表達(dá)基因。

6 目標(biāo)差異表達(dá)基因的GO、代謝通路(KEGG)富集分析

為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，闡述其在分子水平上的作用，通過使用Blast2go功能注釋工具和GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)對得到的目標(biāo)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋，并采用KOBAS(Version 2.1.1)與 KEGG 數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行KEGG注釋。

7 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

筆者從差異表達(dá)基因中挑選了部分感興趣基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)驗(yàn)證。反應(yīng)體系為10μL，包括5μL的SYBR prime Ex TaqTM II，1μL 的cDNA 模板，0.5μL 的10μM PCR forward primer，0.5μL 的10μM PCR reverse primer和 3.0μL 的Rnase free dH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 3min；95℃ 變性10s，60℃ 退火30s，變性和退火重復(fù)35個(gè)循環(huán)；95℃10s，65℃～95℃融解曲線0.5℃增加3min。每個(gè)基因做3次重復(fù)，β-actin作為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后使用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件分析結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，利用GraphPad軟件分析顯著性并作圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。引物序列見表1。

結(jié) 果

1 差異表達(dá)基因分析

使用TPM方法分析對照組與各個(gè)創(chuàng)傷組(TH2h組、TH6h組、TH12h組)間的差異表達(dá)基因，將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后分析其表達(dá)水平，差異表達(dá)基因的篩選條件為|log2FC| >=1 &P<0.01。與對照組相比，TH2h組有903個(gè)差異表達(dá)基因，其中有296個(gè)表達(dá)水平上調(diào)，607個(gè)下調(diào)。TH6h組有1 337個(gè)差異表達(dá)基因，其中有688個(gè)表達(dá)水平上調(diào)，649個(gè)下調(diào)。TH12h組有1 720個(gè)差異表達(dá)基因，其中有884個(gè)表達(dá)水平上調(diào)，836個(gè)下調(diào)。見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因數(shù)量

2 差異基因集Venn分析

通過Venn圖分析對照組vs.TH2h組、對照組vs.TH6h組、對照組vs.TH12h組3組間的差異基因交集，結(jié)果表明，313個(gè)差異表達(dá)基因在3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為目標(biāo)基因集。見圖2。

圖2 創(chuàng)傷后2、6、12h的差異表達(dá)基因集共有的差異表達(dá)基因維恩圖

3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

GO富集的條目分為細(xì)胞組分、生物進(jìn)程(BP)和分子功能。GO功能富集分析表明(表2)，目標(biāo)差異表達(dá)基因主要富集于BPs，如對細(xì)胞因子的響應(yīng)、固有免疫反應(yīng)、對干擾素α響應(yīng)、對干擾素β響應(yīng)以及對病毒的防御反應(yīng)等。此外，GO富集的前20位GO條目中，“干擾素β的細(xì)胞響應(yīng)”的富集指數(shù)最大，富集程度較為明顯。見圖3。

表2 富集豐度在前20的GO條目

4 干擾素誘導(dǎo)(interferon-induced，Ifi)相關(guān)的差異表達(dá)基因聚類分析

GO富集分析表明差異基因富集程度最大是對干擾素β的細(xì)胞反應(yīng)，筆者挑取了這313個(gè)差異表達(dá)基因中屬于Ifi相關(guān)差異表達(dá)基因(分別為：Ifi35、Ifi202b、Ifi44、Ifit1、Ifi206、Ifi209、Ifit2、Ifit3b、Ifi208、Ifit1bl2、Ifi214、Ifi213、Ifit3、Ifi47、Ifit1bl1)進(jìn)行下一步聚類分析。結(jié)果表明，與對照組相比，TH2h組、TH6h組、TH12h組的Ifi相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降(圖4)，說明嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ifi相關(guān)基因的表達(dá)降低，并表現(xiàn)為一定程度的時(shí)間依賴性，從傷后2h開始至傷后12h持續(xù)下調(diào)。

圖4 干擾素誘導(dǎo)相關(guān)基因在對照組、TH2h組、TH6h組、TH12h組的表達(dá)量聚類熱圖

5 qPCR 驗(yàn)證分析

選擇上述聚類中的15個(gè)Ifi基因(分別為：Ifi35、Ifi202b、Ifi44、Ifit1、Ifi206、Ifi209、Ifit2、Ifit3b、Ifi208、Ifit1bl2、Ifi214、Ifi213、Ifit3、Ifi47、Ifit1bl1)進(jìn)行差異表達(dá)基因驗(yàn)證。qPCR法檢測結(jié)果顯示上述Ifi家族15個(gè)基因表達(dá)均下調(diào)，qPCR測得各基因表達(dá)變化下降趨勢與RNA-seq結(jié)果一致(P<0.05)。見圖5。

圖5 干擾素誘導(dǎo)相關(guān)基因在創(chuàng)傷后2、6、12h的腹腔巨噬細(xì)胞中的相對表達(dá)水平表達(dá)量為相對表達(dá)量，對照組中的表達(dá)量為對照。每個(gè)值代表3次重復(fù)的代表試驗(yàn)組與對照組的差異顯著性(**P<0.01)

討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷誘發(fā)機(jī)體免疫功能紊亂是造成創(chuàng)傷后感染/膿毒癥的主要原因。創(chuàng)傷-失血后機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能均處于紊亂狀態(tài),使機(jī)體對病毒、細(xì)菌、真菌等病原體感染的易感性增加，加劇了創(chuàng)傷后感染/膿毒癥的發(fā)生[6]。但是，創(chuàng)傷-失血后巨噬細(xì)胞抗感染能力減弱的具體機(jī)制還未完全明晰，本研究利用RNA-seq技術(shù)有助于系統(tǒng)性探究其變化規(guī)律，為進(jìn)一步闡明機(jī)制及尋找干預(yù)靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

本研究構(gòu)建小鼠雙下肢股骨骨折+眼球40%失血的嚴(yán)重創(chuàng)傷模型，取對照及造模后2、6、12h的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取RNA并進(jìn)行RNA-seq，通過差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷-失血后腹腔巨噬細(xì)胞出現(xiàn)大量的基因表達(dá)變化，除傷后2h下調(diào)較上調(diào)基因數(shù)多外，6h和12h上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)接近。在12h內(nèi)隨著時(shí)間的增加，差異表達(dá)基因的數(shù)量持續(xù)增加(圖1)。創(chuàng)傷早期12h內(nèi)巨噬細(xì)胞的變化不僅是機(jī)體應(yīng)激的反應(yīng)，而且還預(yù)示著后期發(fā)生感染的可能。多數(shù)嚴(yán)重創(chuàng)傷患者感染的高發(fā)期多在1周左右。前期學(xué)者報(bào)道，在創(chuàng)傷-失血性休克模型下，腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能減弱，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類抗原表達(dá)降低，TNF-α的釋放減少，這些變化持續(xù)較長時(shí)間并可達(dá)傷后7d[7]。上述事實(shí)均表明創(chuàng)傷失血后對巨噬細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和免疫功能的影響是持續(xù)的，易導(dǎo)致后續(xù)感染的發(fā)生。為了探究在創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)均持續(xù)變化的基因，筆者團(tuán)隊(duì)利用Venn分析篩選出313個(gè)差異表達(dá)基因的目標(biāo)基因集(圖2)，進(jìn)一步GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)該基因集主要富集于BPs，如對細(xì)胞因子的響應(yīng)、固有免疫反應(yīng)、對干擾素α響應(yīng)、對干擾素β響應(yīng)以及對病毒的防御反應(yīng)等(表2、圖3)。上述差異基因主要參與了對Ⅰ型干擾素和病毒的反應(yīng)。眾所周知，在病毒感染的早期，機(jī)體通過模式識別受體識別病原體相關(guān)分子模式PAMPAs，迅速誘發(fā)Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)的表達(dá)并促使一系列干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒能力，并誘發(fā)病毒感染細(xì)胞的凋亡，從而限制病毒的復(fù)制和傳播，為病毒感染提供第一道防線[8]。免疫調(diào)節(jié)干預(yù)措施IFN-γ有助于增加宿主的抗原提呈能力，但隨機(jī)對照臨床RCT試驗(yàn)表明IFN-γ的作用效果存在爭議，在4項(xiàng)研究中僅有2項(xiàng)降低病死率和感染發(fā)生率[3]，提示IFN的確切作用還需深入探究及證實(shí)。多年來，IFN被證明具有多種生物學(xué)功能，在抗病毒感染應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面具有重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，HIV病毒感染會(huì)下調(diào)原代巨噬細(xì)胞中許多ISG(IFI27，IFI44，IFI44L和ISG15)的轉(zhuǎn)錄[9]。與艾滋患者感染HIV病毒后免疫抑制狀態(tài)類似，創(chuàng)傷-失血后巨噬細(xì)胞中ISG的轉(zhuǎn)錄也明顯降低，可能與嚴(yán)重創(chuàng)傷患者表現(xiàn)的免疫功能紊亂相關(guān)。

綜合分析基因富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GO功能富集氣泡圖中，“干擾素β的響應(yīng)”這一GO條目的富集因子最大，富集的基因數(shù)較多。在上述條目中，存在大量Ifi相關(guān)基因，而且這些基因本身就是抗感染早期的重要指標(biāo)。筆者挑選了15個(gè)Ifi基因進(jìn)行基因聚類分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后這些基因的表達(dá)水平均降低，而且RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與測序一致(圖5) 。其中Ifit家族基因在干擾素應(yīng)答過程中高表達(dá)，在小鼠中有3個(gè)Ifit家族成員(Ifit1/ Ifit2/ Ifit3)，在人類中多1個(gè)Ifit5共有4個(gè)成員，已被證實(shí)具有直接或間接的抗病毒活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控病毒和細(xì)菌感染期間宿主先天免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥因子反應(yīng)等作用[10]，也可作為M1型巨噬細(xì)胞的最新極化標(biāo)志物[11]。Ifit1已被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞先天免疫重要的瓶頸，對下游基因和先天性免疫功能具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[12]。Ifit1的敲除促進(jìn)了諾如病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，Ifit1并不直接抑制病毒翻譯，而是通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞中干擾素β的表達(dá)，從而限制病毒復(fù)制[13]。Ifit2也可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞IFN-α/β的誘導(dǎo)表達(dá)，限制了西尼羅河病毒在大腦的感染[14]。Ifit1不僅是一種抗病毒蛋白，近來也被證明是細(xì)菌誘導(dǎo)的促炎基因和干擾素基因的相互調(diào)節(jié)因子，與染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和宿主對細(xì)菌感染的反應(yīng)[15]。Ifit1對于巨噬細(xì)胞有效控制革蘭氏陰性細(xì)菌感染十分關(guān)鍵，Ifit1缺失增強(qiáng)了機(jī)體對細(xì)菌的敏感性，表明Ifit1對基因表達(dá)的調(diào)控對于維持宿主細(xì)胞中病原體感染的抗性和轉(zhuǎn)錄平衡至關(guān)重要[15]。這些結(jié)果表明Ifi基因表達(dá)水平的下降可能是導(dǎo)致創(chuàng)傷后機(jī)體的抗病毒、細(xì)菌感染和免疫能力降低的重要原因，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

其他結(jié)果指出，Ifit的下調(diào)也可能是一種代償性保護(hù)機(jī)制。Ifit2促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大，可能參與了感染性休克的發(fā)生。IFN刺激的Ifit2通過增強(qiáng)IRF3磷酸化上調(diào)促炎細(xì)胞因子的分泌，Ifit2缺陷小鼠的血清IL-6和TNF-α水平顯著降低[16]。Ifit3基因的敲除和表達(dá)下調(diào)，不僅可緩解心肌梗死小鼠的炎癥反應(yīng)和心肌纖維化，改善其心功能[11]，還能改善肝臟缺血再灌注損傷，抑制炎性細(xì)胞因子的釋放[17]。Ifi35有助于增加免疫細(xì)胞的招募和IL-12p40的產(chǎn)生，與H5N1流感病毒感染的易感性增加有關(guān)[18]。此外，Ifi202b是參與單核巨噬細(xì)胞分化和促進(jìn)炎癥消退的關(guān)鍵因子，有助于傷口的愈合[19]，Ifi202b敲低阻斷了基質(zhì)血管部分的脂肪生成并減少了骨髓來源巨噬細(xì)胞中的炎癥[20]。創(chuàng)傷-失血后引起的Ifi202b轉(zhuǎn)錄下調(diào)，可能與單核巨噬細(xì)胞分化、傷口愈合和骨髓來源巨噬細(xì)胞炎癥的變化相關(guān)。

綜上所述，作為干擾素刺激基因中Ifi家族基因的表達(dá)水平在創(chuàng)傷-失血后急劇下降，說明了Ifi相關(guān)基因在創(chuàng)傷-失血后的抗感染進(jìn)程中可能起重要作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究，靶向調(diào)控Ifi家族基因的表達(dá)可能為創(chuàng)傷失血后抗感染提供一種新的思路。

作者貢獻(xiàn)聲明:殷雙琴、羅莉：研究實(shí)施、數(shù)據(jù)收集、論文撰寫及修改、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳濤：實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)收集分析；梁星河、曠田垠、代偉宏：實(shí)驗(yàn)操作、論文修改；梁華平：研究指導(dǎo)、論文指導(dǎo)及修改、經(jīng)費(fèi)支持；朱俊宇：研究實(shí)施、數(shù)據(jù)收集、論文撰寫及修改、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、經(jīng)費(fèi)支持