miR-4306通過下調SATB2表達抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移與侵襲

李書林， 廖藝琳， 周子杰， 肖鄭偉， 蘇凌波，李俊杰， 藍青， 陳名迪， 郭徽靈， 顏來鵬， 湯發強

(1. 福建醫科大學省立臨床醫學院，福建 福州 350001； 2. 福建省立醫院骨一科，福建 福州 350001； 3. 福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350001； 4. 福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350001)

骨肉瘤是目前最常見的原發性惡性骨癌，起源于惡性間充質細胞[1]。骨肉瘤患者治療以往主要依靠手術切除，存活率僅為20%；隨著化療和放療技術的引入，患者長期存活率達65%～70%[2]。然而，由于腫瘤的侵襲性和轉移性，伴有肺轉移性骨肉瘤患者5年存活率僅有20%左右[3-4]。因此，深入探究骨肉瘤侵襲、轉移的機制對提高骨肉瘤的療效具有重要意義。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一組內源性非編碼的小核糖核酸，廣泛分布于真核細胞中，其與靶基因的3′-UTR結合參與轉錄后調節[5]。據統計，超過30%蛋白表達受miRNA調節[6]。miRNA異常表達或突變與多種癌癥相關，并可充當腫瘤標志物或癌基因[7-8]。miR-4306參與調控多種惡性腫瘤的生物學行為，如宮頸癌[9]、乳腺癌[10]和甲狀腺乳頭狀癌[11]等。亦有研究報道，miR-4306可通過血管內皮細胞生長因子A(VEGFA)抑制ERK1/2/NF-κB信號傳導，從而抑制人單核細胞衍生的巨噬細胞遷移[12]。目前，關于miR-4306在骨肉瘤中的作用尚不明確。因此，本研究擬探討miR-4306在骨肉瘤細胞中的表達及其對骨肉瘤發生發展的影響和潛在機制。

1 材料和方法

1.1 細胞及主要試劑

DMEM購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國PAN Biotech公司；miR-4306模擬物(miR-4306 mimics)和模擬物陰性對照(mimics NC)購自上海市吉凱生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega生物公司；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司；ECL發光試劑購自美國Thermo公司；轉染試劑Lipofectamine 2000、qRT-PCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室及24孔細胞培養板購自美國Corning公司；β-肌動蛋白、富含AT序列特異性結合蛋白2(specail AT-rich sequence-binding protein 2, SATB2)、上皮-間質轉化(EMT)標志蛋白N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)IgG一抗以及HRP標記的IgG二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 細胞培養及miR-4306相對表達水平檢測

1.2.1 細胞培養 人成骨細胞hFOB 1.19和骨肉瘤細胞Saos-2、MNNG/HOS CI #5用含10%胎牛血清的DMEM，于37 ℃含有5% CO2細胞培養箱中培養。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-4306相對表達水平 采用傳統Trizol法提取人源成骨細胞hFOB 1.19和骨肉瘤細胞Saos-2、MNNG/HOS CI #5中總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。取cDNA等試劑按照試劑盒說明書配置20 μL反應體系：cDNA 2.0 μL、qPCR SYBR?Green Master Mix 10.0 μL、滅菌蒸餾水7.0 μL和上、下游引物各0.5 μL。qRT-PCR反應步驟：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃退火30 s，40個循環。qRT-PCR引物序列如下：miR-4306上游為5′-CGCGCGTGGAGAGAAAG-3′，下游為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-5′；內參U6上游為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。最后根據2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.3 細胞分組、轉染及相關指標檢測

1.3.1 細胞分組及轉染 將細胞分為miR-4306 mimics組和mimics NC組。當細胞融合度達50%～70%時，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將miR-4306 mimics及陰性對照稀釋至5 mmol/L，分別加入細胞培養基中，轉染約6 h后更換為含10%胎牛血清的新鮮DMEM，進一步培養24～48 h。用qRT-PCR檢測轉染效果，具體方法同“1.2.2”，確認轉染成功后將細胞用于后續實驗。

1.3.2 CCK-8檢測細胞增殖 取“1.3.1”轉染細胞，培養24 h；接種于96孔板，分別在0、24、48、72 h向每孔細胞中加入100 μL 10% CCK-8溶液，繼續培養1～2 h。用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm處各孔光密度(D)值，并計算細胞增殖抑制率。

1.3.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 取“1.3.1”轉染細胞，胰酶消化，完全培養基重懸，制成細胞懸液并計數；將細胞接種于6孔板中，800個/孔，每組設3個復孔，加入含10% 胎牛血清的完全培養基，搖勻后輕放于培養箱中繼續培養；每隔3 d換液一次并觀察細胞狀態，顯微鏡下觀察克隆大小；待孔中大多數單個克隆中細胞數>50時，棄上清液，PBS洗滌細胞1次；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，4 ℃固定60 min；PBS洗滌細胞1次。通過計數得出克隆形成率，對細胞的增殖能力作定量分析。

1.3.4 Transwell實驗檢測細胞遷移 取“1.3.1”轉染細胞，消化后離心棄培養液，用PBS洗1～2遍，用無血清培養基重懸；調整各組細胞數量至1×105個/mL，取細胞懸液100 μL加入Transwell小室上表面，下室加入600 μL含20% 胎牛血清的培養基，37 ℃孵育24 h；用棉簽擦去上室細胞，下室細胞用PBS沖洗；4%多聚甲醛固定30 min；用0.1%結晶紫溶液染色15 min。最終，每組在顯微鏡下隨機選取視野拍照，觀察細胞并計數。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲 將Martrigel基質膠置于4 ℃至完全融化，用無血清培養基以1 ∶8于冰上稀釋Martrigel標準膠，取50 μL 稀釋的Martrigel膠包被Transwell上室，4 ℃風干，37 ℃使其徹底凝固。

實驗組：對實驗組疑似乳腺癌患者實施MRI檢查，患者在這段過程中保持仰臥體位，對冠狀位、矢狀位和橫斷位先進行常規掃描，再進行增強掃描，將對比劑注入患者肘靜脈。將掃描參數設置為層厚1.2毫米，掃描6次，每次間隔20秒，掃描時長60秒，在掃描過程中發現病灶要通過患者靜脈注射每千克體重0.1mmol的對比劑，掃描時長為6min20s。

取“1.3.1”轉染細胞，每組1×105個/mL細胞(100 μL)接種于Transwell上室，再將Transwell小室放入含10% 胎牛血清培養基的24孔板中培養24～48 h；取出Transwell小室，用棉簽擦拭小室內部細胞及殘余的 Matrigel膠，PBS清洗3次；4%多聚甲醛固定30 min；0.1%結晶紫溶液染色15 min；鏡檢計數并分析作圖。

1.3.6 蛋白質免疫印跡檢測細胞內SATB2及EMT相關蛋白表達 取“1.3.1”轉染細胞，加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上靜置20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min；取上清液400 μL于EP管，按BCA試劑盒說明書操作，測定蛋白濃度；按1 ∶5比例加入5×上樣緩沖液，金屬浴中95 ℃孵育10 min。每孔上樣30 μg蛋白，行10% SDS-PAGE，80 V 30 min，120 V 60 min；恒壓100 V 90 min，將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗SATB2、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白和VEGF(均1 ∶1 000稀釋)以及內參β-肌動蛋白(1 ∶5 000稀釋)，搖床4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，10 min/次；加入二抗(1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次，10 min/次；ECL顯色。用Image J分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白表達相對含量。

1.4 miR-4306靶基因預測和鑒定

經在線靶基因預測網站Targetscan、Starbase發現 miR-4306與SATB2的3′-UTR端有互補結合位點，用雙熒光素酶報告系統鑒定靶向關系。分別將SATB2 WT和MUT熒光素酶報告載體同miR-4306 mimics、mimics NC共轉染到骨肉瘤細胞中，具體分組如下：Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics組、Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics NC組、Luc-SATB2-MUT+miR-4306 mimics組、Luc-SATB2-MUT+miR-4306 mimics NC組。24 h后收集細胞，每孔加入200 μL裂解液裂解細胞，4 ℃裂解20 min，將裂解后的細胞樣品保存至-80 ℃；每組取細胞裂解液70 μL加至96孔板，每孔加熒光素酶檢測試劑100 μL，上機檢測螢火蟲熒光素酶活性；取100 μL海腎熒光素酶檢測試劑(檢測底物 ∶緩沖液=1 ∶100)加入每孔，上機檢測海腎熒光素酶活性。用蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中SATB2蛋白表達水平，方法同“1.3.6”。

1.5 細胞分組與共轉染

將細胞分組如下：miR-4306 mimics NC+LV-NC組、miR-4306 mimics NC+LV-SATB2組、miR-4306 mimics+LV-NC組和miR-4306 mimics+LV-SATB2組；構建SATB2過表達載體(LV-SATB2)及空載組(LV-NC)，將miR-4306 和SATB2共轉染至骨肉瘤細胞株中。隨后通過CCK-8、克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲，蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中SATB2蛋白表達水平和EMT相關蛋白表達水平，具體實驗方法同前。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 miR-4306在骨肉瘤細胞系中表達

結果顯示，與人成骨細胞hFOB 1.19相比，人骨肉瘤Saos-2，MNNG/HOS CI #5細胞中miR-4306表達水平明顯降低(P均<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與人成骨細胞hFOB 1.19相比

2.2 miR-4306過表達抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移和EMT

如圖2所示，在骨肉瘤Saos-2和MNNG/HOS CI #5細胞中，miR-4306 mimics組中miR-4306表達水平顯著高于mimics NC組(t=-30.02，-108.05，P均<0.01)；與mimics NC組相比，miR-4306 mimics組24、48、72 hD值及克隆形成率均顯著降低(P<0.05或<0.01)，細胞遷移及侵襲能力均明顯降低(P<0.05或<0.01)。此外，與mimics NC組相比，miR-4306 mimics組中N-鈣黏蛋白、VEGF蛋白表達水平均明顯降低(P均<0.01)，E-鈣黏蛋白表達水平明顯升高(P均<0.01)。由此表明，miR-4306 過表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移和EMT。

2.3 SATB2是miR-4306的直接靶標

通過在線靶基因預測網站Starbase, Targetscan發現，miR-4306與SATB2存在互補結合位點(圖3A)；雙熒光素酶實驗結果顯示，與Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics NC組比，Luc-SATB2-WT+miR-4306 mimics組熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)，而在Luc-SATB2-MUT的共轉染組中兩者熒光素酶活性未見明顯差異(圖3B)。此外，骨肉瘤細胞Saos-2和MNNG/HOS CI #5中SATB2 mRNA表達水平明顯高于人成骨細胞hFOB 1.19(t=-7.76，-5.27，P均<0.01，圖3C)；與mimics NC組相比，miR-4306 mimics組SATB2蛋白表達水平明顯降低(t=12.76，t=13.56，P均<0.01，圖3D)。由此表明，SATB2是miR-4306的下游直接靶標，上調miR-4306可抑制骨肉瘤細胞中SATB2蛋白表達。

2.4 miR-4306通過下調SATB2表達抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲和EMT

結果顯示，在Saos-2和MNNG/HOS CI #5細胞中，與miR-4306 mimics NC+LV-NC組相比，miR-4306 mimics NC+LV-SATB2組D值及克隆形成率均顯著升高(P<0.05或<0.01)，細胞遷移及侵襲能力亦明顯增強(P<0.05或<0.01)，N-鈣黏蛋白、VEGF蛋白表達水平明顯上調(P<0.05或<0.01)，E-鈣黏蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或<0.01)；與miR-4306 mimics+LV-NC組相比，miR-4306 mimics+LV-SATB2組D值及克隆形成率均顯著升高(P<0.01或<0.05)，細胞遷移及侵襲能力亦明顯增強(P<0.05或<0.01)，N-鈣黏蛋白和VEGF蛋白表達水平明顯上調(P均<0.01)，E-鈣黏蛋白表達水平明顯降低(P均<0.01)。見圖4。由此可見，LV-SATB2一定程度上可逆轉miR-4306對骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移和EMT的影響。

3 討論

研究表明，致癌基因的異常激活和抑癌基因由于體細胞突變和表觀遺傳的失活在骨肉瘤中起著關鍵的致病作用[13]。miR-4306作為一個腫瘤調控因子，其表達水平的高低與腫瘤細胞的生物學行為相關。Zhao等[10]在對三陰性乳腺癌的研究中證實，miR-4306可發揮類似抑癌基因的作用，從而影響三陰性乳腺癌細胞的惡性生長與侵襲。本研究發現，miR-4306在多種骨肉瘤細胞株中的表達均明顯下調，這與前期的miR-4306與腫瘤相關研究一致[9-10]。

EMT是上皮特征逐漸消失并逐漸表現出間質特征的過程，其在胚胎發育、組織修復以及各種腫瘤發生、侵襲、轉移和耐藥性中均發揮重要作用[14]。研究證實，腫瘤細胞EMT過程中伴隨著多種標志性蛋白表達改變，如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和VEGF蛋白等[15-16]。本研究發現，轉染miR-4306 mimics后，骨肉瘤細胞中E-鈣黏蛋白表達水平明顯升高，同時N-鈣黏蛋白和VEGF蛋白表達水平明顯下降，提示miR-4306抑制骨肉瘤細胞的侵襲、遷移和EMT。

A：qRT-PCR檢測骨肉瘤細胞中miR-4306相對表達量；B：CCK-8檢測細胞增殖能力；C：克隆形成實驗檢測細胞增殖；D：Transwell實驗檢測細胞遷移；E：Transwell實驗檢測細胞侵襲；F：蛋白免疫印跡法檢測信號通路蛋白表達；**：P<0.01，*：P<0.05，與mimics NC組相比；#：P<0.05，##：P<0.01，與同時間點mimics NC組相比

A：預測miR-4306與SATB2存在互補結合位點；B：雙熒光素酶實驗證實miR-4306與SATB2的靶向結合位點；C：qRT-PCR檢測人成骨細胞hFOB 1.19以及骨肉瘤細胞Saos-2，MNNG/HOS CI #5中SATB2 mRNA相對表達水平；D：蛋白質免疫印跡檢測轉染后骨肉瘤細胞中SATB2蛋白相對表達水平；**：P<0.01，與mimics NC組相比；##：P<0.01，與人成骨細胞hFOB 1.19相比

此外，本研究采用Starbase、Targetscan等生物靶基因預測網站分析，并通過雙熒光素酶報告基因實驗證實，SATB2是miR-4306的直接下游靶基因。SATB2是一種轉錄因子和表觀遺傳調節因子，其在中樞神經發育、癌癥發展和預后以及免疫調節方面發揮重要作用[17-18]。研究表明，SATB2可通過抑制非小細胞肺癌細胞中的EMT介導的轉錄因子的表達來防止EMT誘導，而SATB2基因敲除可促進轉化生長因子-β誘導的非小細胞肺癌細胞EMT和侵襲[19]。本研究結果顯示，SATB2在骨肉瘤細胞系中表達水平明顯上調；此外，通過轉染SATB2過表達載體上調SATB2表達后發現，miR-4306對骨肉瘤細胞侵襲、遷移和EMT的抑制作用明顯減弱，提示miR-4306通過抑制SATB2表達參與調控骨肉瘤細胞的生物學行為。

綜上所述，miR-4306在骨肉瘤轉移以及惡性進程中發揮類似抑癌基因的作用，其可能與抑制下游SATB2表達有關。本研究目前僅通過體外細胞實驗探討miR-4306對骨肉瘤發生與發展的作用機制，尚缺乏臨床樣本及動物實驗的驗證，有待后續進一步完善。