兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 及H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒作用研究

胡月

流感病毒屬于正黏病毒科,依據其外膜血凝素(H)和神經氨酸酶(N)蛋白抗原性不同,目前可分為若干個亞型(H1～H16,N1～N9)［1］,H1N1 是感染人的最主要甲型流感病毒,是臨床上最常見的引起上呼吸道感染的流感病毒株,臨床上表現為突發高熱、咳嗽、咽痛、流涕或鼻塞、頭痛、肌肉和關節痛、全身不適等多種流感樣癥狀,影響患者的工作和生活［2］。目前,流感疫苗仍是最主要的流感預防措施,但因為流感病毒在不斷變異,存在疫苗的研究和生產跟不上病毒變異速度的問題［3］。西藥抗病毒毒副作用大,特異性低,易于產生耐藥。中醫藥防治流感病毒臨床診治經驗豐富,療效確切,毒副作用低,患者接受度高。本研究委托中國科學院武漢病毒研究所,以利巴韋林為陽性對照,在MDCK 細胞水平上,評價兒童清咽解熱口服液對H1N1及H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑

1.1.1.1 受試藥物 兒童清咽解熱口服液,由亞寶藥業四川制藥有限公司生產,批號171041。

1.1.1.2 對照藥物 利巴韋林標準品,購置于大連美侖生物科技有限公司,批號20160518。

1.1.1.3 試劑和儀器 ①試劑：DMEM 培養基(Life Science: Cat.No.12800-17,Lot No.1837973)、FBS(Biological Industry: Cat.No.04-001-1ACS-500 ml,Lot No.1837973)、青-鏈霉素(碧云天：Cat.No.ST488,配置成200000 U/ml)、DMEM 完全培養基(DMEM+10%FBS+100 U/ml PS)、RPMI1640 完全培養基(RPMI1640+10%FBS+100 U/ml PS)、磷酸鹽緩沖液(1000 ml ddH2O中加入NaCl 8.1816 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 3.58 g,KH2PO40.24 g,攪拌溶解,調pH 至7.3)、胰酶(Trypsin)、CellTiter GloTM(Promega,貨號：G7572,Lot No.0000158064)。②儀器及實驗環境：二氧化碳(CO2)培養箱(Thermo)、生物安全柜(哈東聯)、酶標儀(PerkinElmer,型號Envision)、細胞計數儀(Bio-Rad,型號TC10TM)、倒置顯微鏡(Zeiss Observer,型號A1)、高內涵細胞分析儀(PerkinElmer HCS)。

1.1.2 細胞與病毒 細胞：MDCK 來源于中國病毒保藏中心,從美國模式培養物集存庫(ATCC)購置,本實驗室傳代保存為P8～P11 代。培養條件：DMEM+10%FBS、37℃、5% CO2。H1N1 病毒：A 型流感病毒(H1N1,A/PuertoRico/8/1934),該批次病毒編號為20161102NS。H1N1 奧司他韋耐藥病毒株：來源于中國病毒保藏中心,由本實驗室擴增保存。

1.2 方法

1.2.1 藥物對細胞的毒性測定 實驗采用CellTiter-GloTM熒光法檢測受試藥物對細胞的毒性作用。將MDCK 細胞接種于96 孔細胞培養板中,細胞貼壁后備用。兒童清咽解熱口服液和利巴韋林用DMEM 培養基從2 倍最高測試濃度起連續3 倍梯度稀釋8 個梯度,再將不同濃度的藥物及適量培養基加入到細胞中,于37℃的CO2培養箱中培養。加入不同濃度兒童清咽解熱口服液或利巴韋林培養22 h 后,顯微鏡下觀察藥物引起的細胞病變效應(CPE),并加入CellTiter-Glo 檢測細胞存活率。藥物對細胞的毒性以細胞的活性表示。計算公式：細胞活性(%)=(熒光值藥物組-熒光值空白對照)/(熒光值細胞對照-熒光值空白對照)×100。

利用Graphpad Prism 作圖并計算CC50和CC0.1。其中CC50通過軟件中的計算公式log(inhibitor) vs.normalized response-Variable slope 計算得出,而CC0.1通過軟件中的計算公式log(agonist) vs.response -Find ECanything 計算得出。

1.2.2 病毒毒力的測定(TCID50) 將H1N1 和H1N1奧司他韋耐藥病毒株連續10 倍遞次稀釋為l0-1～10-8后,將各稀釋度的病毒接種于MDCK 細胞中,每個稀釋度4 孔,于37℃吸附1 h 后換用維持液繼續培養,設正常細胞對照孔和病毒對照孔。72 h 后,取細胞培養液上清測定血凝素(HA),并用Reed-Muench 法計算各病毒的TCID50。

1.2.3 抗病毒活性評價 將100 TCID50的H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥病毒株與藥物同時加入細胞中,各組均為2 個復孔,并設置不加藥物的病毒對照組和正常細胞對照組。各組細胞于37℃培養22 h,采用間接免疫熒光的方法測定細胞培養液上清中病毒復制水平,實驗采用流感病毒NP 蛋白的單克隆抗體特異性結合NP 蛋白,之后用熒光標記的二抗結合一抗,檢測熒光信號的數量及強度。通過熒光信號的數量判斷病毒復制的水平,觀察兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株病毒增殖的影響。抑制率(%)=100-(樣品孔數值-空白對照數值)/(病毒對照數值-空白對照數值)×100,利用Graphpad Prism 6 作圖并計算

2 結果

2.1 藥物對細胞的毒性測定 在MDCK 細胞上,兒童清咽解熱口服液的CC0.1為0.85 mg/ml,利巴韋林的CC0.1＞73.26 μg/ml。見 表1,表2。CellTiter-GloTM免 疫熒光法測定結果與CPE 法一致。采用Graphpad Prism作圖計算兒童清咽解熱口服液的CC50為44.97 mg/ml。

表1 CPE 法觀察藥物對MDCK 細胞最大無毒濃度

表2 CellTiter-GloTM 免疫熒光法測定不同藥物濃度作用的細胞活性及培養上清OD 值()

表2 CellTiter-GloTM 免疫熒光法測定不同藥物濃度作用的細胞活性及培養上清OD 值()

注：細胞對照組OD 值為(1004118.33±55369.80)

2.2 病毒毒力測定結果 根據實驗結果,采用CellTiter-GloTM免疫熒光法計算H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株的TCID50值分別為107.83/ml 和108.0/ml,本實驗采用病毒量為100 TCID50。

2.3 兒童清咽解熱口服液抗病毒活性評價

2.3.1 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1、H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的效果 在MDCK 細胞上采用藥物和病毒同時加入的方式觀察藥物的抗病毒作用,37℃培養22 h 后培養液上清中高內涵熒光OD 值和抑制率見表3,表4。兒童清咽解熱口服液OD 值明顯低于病毒對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。說明兒童清咽解熱口服液有較好的抗H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒作用。

表3 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 流感病毒效果()

表3 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 流感病毒效果()

注：病毒對照組OD 值為(11697.25±4586.81)

表4 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒效果()

表4 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒效果()

注：病毒對照組OD 值為(7553.75±1182.54)

2.3.2 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 的EC50和SI 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 的EC50為2.70 mg/ml,SI 為16.66,兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對流感病毒H1N1 的抑制作用和對MDCK 細胞的毒性結果見圖1,表5。

表5 兒童清咽解熱口服液對流感病毒H1N1 的抑制作用和對細胞的毒性作用

圖1 兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對H1N1 病毒的抑制作用和對細胞的毒性作用

2.3.3 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的EC50和SI 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1奧司他韋耐藥株流感病毒的EC50為2.29 mg/ml,SI 為19.63,兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對流感病毒H1N1 奧司他韋耐藥株的具體抑制作用和對MDCK細胞的毒性結果見圖2,表6。

表6 兒童清咽解熱口服液對流感病毒H1N1 奧司他韋耐藥株的抑制作用和對細胞的毒性作用

圖2 兒童清咽解熱口服液對H1N1 奧司他韋耐藥株病毒的抑制作用和對細胞的毒性作用

3 討論

兒童清咽解熱口服液主要成分為柴胡、黃芩苷、紫花地丁、人工牛黃、苣荬菜、魚腥草、蘆根和赤小豆,具有清熱解毒,消腫利咽的功效。小兒急性咽炎(急喉痹)屬肺胃實熱證,癥見：發熱,咽痛,咽部充血,或咳嗽,口渴等。現代藥理學研究證實兒童清咽解熱口服液具有抗炎、抗菌、抗病毒、調節機體免疫功能等作用［5-8］。臨床上將其用于小兒急性咽炎的治療,對小兒急性咽炎咽痛、大便干、咽紅腫等癥狀有明顯的改善作用,而且經濟性好［9-12］。

本研究探討了兒童清咽解熱口服液采用中和的給藥方式對H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的抑制作用。研究通過CPE 和CellTiter-GloTM免疫熒光檢測方法觀察兒童清咽解熱口服液對病毒感染細胞的保護作用。相較于傳統細胞毒測定方法,CellTiter-GloTM免疫熒光法檢測效率更高,更為可靠。CellTiter-GloTM免疫熒光法通過對三磷酸腺苷(ATP)進行定量測定來檢測培養物中活細胞數目。有代謝活性細胞的呼吸作用和其他生命活動過程可以產生ATP,而發光過程中熒光素酶需要ATP 的參與,活的細胞就形成穩定輝光型信號,并在高內涵細胞分析儀被檢測到。抗病毒活性檢測通過采用間接免疫熒光的方法測定流感病毒蛋白表達水平來檢測病毒的復制水平。實驗采用流感病毒NP 蛋白的單克隆抗體特異性結合NP 蛋白,之后用熒光標記的二抗結合一抗,檢測熒光信號的數量及強度,病毒結構蛋白的表達水平與病毒的復制水平呈正比,因此可以通過熒光信號的數量判斷病毒復制的水平。實驗結果表明,兒童清咽解熱口服液采用中和給藥方式對H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒均有顯著抑制作用。兒童清咽解熱口服液CC50為44.97 mg/ml,對H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的EC50分別為2.70、2.29 mg/ml,在H1N1 和H1N1奧司他韋耐藥株上的SI 分別為16.66 和19.63。一般認為SI＞1 時,藥物具有低毒高活性［4］,結果顯示兒童清咽解熱口服液具有體外抗H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥病毒株的作用,顯示出較好的安全性及有效性。

急性咽炎是急性上呼吸道感染的一種,急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱,亦常用“感冒”、“鼻炎”、“急性鼻咽炎”、“急性咽炎”、“急性扁桃體炎”等名詞診斷,統稱為上呼吸道感染,是小兒最常見的急性感染性疾病。急性呼吸道感染的病原體以病毒為主,占90%以上,常見病毒包括鼻病毒、柯薩奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒。非典型病原體在呼吸道感染中所占比例也呈逐漸升高趨勢,其中肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌等。常見細菌僅為原發性上呼吸道感染的10%左右,病原菌以β 溶血性鏈球菌、肺炎球菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌等為主。本項研究結果證實兒童清咽解熱口服液不僅對引起急性上呼吸道感染的常見病毒株H1N1 有效,還對奧司他韋耐藥H1N1 病毒株有效,為兒童清咽解熱口服液臨床上治療小兒上呼吸道病毒感染性疾病提供了啟示和指導。