瓜蔞牛蒡湯對哺乳期乳腺炎小鼠的改善作用及機制研究*

張立清 李 婕 洪秀宇 聶 娟 肖建琴

浙江省安吉縣中醫醫院 1 外科 2 醫教科 313300

哺乳期乳腺炎(Lactation mastitis，LA)是哺乳期婦女的常見多發病，臨床癥狀為乳房結塊腫脹疼痛，伴有全身發熱感染癥狀[1]。其發病原因多為乳管阻塞后乳汁分泌不暢、或乳頭破損引起金葡萄球菌等感染性細菌直接或間接入侵乳腺組織引發感染所致，嚴重者可累及全身[2-3]。但隨著對LA的深入研究，對其認知已從單純感染性疾病過渡到免疫炎癥性疾病[4]。Toll樣受體4(TLR4)信號通路激活與LA患者體內炎癥因子水平升高，與LA局部疼痛和全身感染癥狀密切相關[4-6]。

中醫認為LA與“乳癰”癥狀類似，常用內服、外敷中藥方劑，并配合手法通乳對其進行對癥治療[7]。臨床研究發現，內服瓜蔞牛蒡湯治療可較大程度降低LA患者全身的炎癥反應、緩解乳房疼痛不適感并減輕乳汁淤積[8-10]，但其作用機制尚不明確。因此，本研究通過建立乳腺炎體內、體外模型，探究瓜蔞牛蒡湯防治LA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與材料：小鼠乳腺上皮細胞EMT6細胞(賽百慷)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS；貨號：L2880，Sigma)；小鼠的白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、IL-1β、IL-10的ELISA試劑盒(貨號：SBJ-M0044、SBJ-M0027、SBJ-R0095，森貝伽)；小鼠腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的ELISA試劑盒(貨號：MM-0132M2，酶免)；小鼠IL-12的ELISA試劑盒(貨號：ZC-36383，zcibio)；β-actin、核因子κB(NF-κB-p65)、p-NF-κB-p65、TLR4、TNF-α抗體(貨號：3700S、8242S、3033S、14358S、3707S，CST)；CCK-8試劑盒(貨號：HY-K0301，MCE)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：pc0020，Solarbio)。20只SPF級健康SD大鼠、36只ICR孕鼠均購于上海西普爾—必凱實驗動物有限公司[動物生產許可證號SCXK(滬)2018-0008]，常規飼養于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心[動物使用SYXK許可證號(浙)2020-0024]，批準號EYOUNG-20210108-01。

1.1.2 實驗儀器：細胞培養箱(型號BB150，Thermo公司)：脫水機、包埋機(型號：JJ-12J、JB-P5，武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司)；光學顯微鏡(型號：AE2000，Motic)：倒置熒光顯微鏡(型號：Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康)；酶標儀(型號：CMaxPlus，MD)。

1.2 方法

1.2.1 瓜蔞牛蒡湯制備和含藥血清制備：瓜蔞15g、牛蒡子12g、黃芩9g、梔子12g、金銀花9g、連翹9g、蒲公英15g、炮山甲6g、皂角刺9g、陳皮9g、青皮9g、炒王不留行10g、漏蘆9g、赤芍9g、甘草6g(藥物均由廣東一方制藥有限公司提供)，加水煎熬制備成200ml瓜蔞牛蒡湯。隨機挑選SD大鼠，分別灌胃等量蒸餾水、瓜蔞牛蒡湯(15g/kg)或頭孢曲松鈉(100g/kg)，連續7d。結束后在無菌條件下予麻醉行腹主動脈采血(5ml)，靜置離心，獲取正常血清和兩種含藥血清經處理后于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 細胞處理及分組：EMT6細胞培養于RPMI 1640培養基，放置于5%CO2的恒溫培養箱中傳代培養。將1×105細胞取出接種于12孔細胞繼續培養，待細胞長至培養基80%時，將細胞隨機分為空白組(等量正常血清)，模型組(等量正常血清)，低、中、高瓜蔞牛蒡湯血清組(分別含5%、10%、15%瓜蔞牛蒡湯血清)及頭孢曲松鈉血清組(含10%頭孢曲松鈉血清)。除空白組外，各組細胞均加入1μg/ml的LPS，培養24h，隨后各組加入相應血清干預24h。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活力：各組細胞接種于96孔板內，培養24h，每孔加入10μl CCK-8溶液，培養箱內孵育。用酶標儀測定450nm處的吸光度，計算細胞活力。

1.2.4 雌鼠造模及分組：取產后5～7d的ICR雌鼠與崽鼠分籠子禁食1～3h，隨機分為sham組、model組、不同劑量(7.5、15、30g/kg)瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組(100mg/kg)，每組6只。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液對雌鼠進行麻醉后，仰臥固定，暴露乳頭，酒精棉球局部消毒，剪去1mm乳尖，充分暴露出乳導管，往第四對乳腺乳池注入0.2mg/ml的LPS(sham組在該手術操作下不進行LPS注射)。造模后sham組、model組雌鼠給予等量生理鹽水灌胃，各瓜蔞牛蒡湯組雌鼠分別灌胃7.5g/kg、15g/kg、30g/kg的瓜蔞牛蒡湯，陽性藥物組雌鼠灌胃100 mg/kg頭孢曲松鈉，給藥治療4周。完成后安樂死雌鼠，經腹主動脈采血，離心收集血清保存備用。

1.2.5 HE染色：取各組雌鼠乳腺組織，常規石蠟包埋、切片，行HE染色，經蘇木素染色5min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30s，自來水浸泡，伊紅液復染2min，自來水沖洗，常規脫水，透明，封片。顯微鏡觀察HE染色切片。

1.2.6 ELISA檢測：按照ELISA試劑盒說明書，對各細胞組上清液IL-6、TNF-α、IL-1β含量和雌鼠血清IL-12、IL-10、IL-1β含量進行測定。

1.2.7 Western blot檢測：離心收集各組細胞，制備雌鼠乳腺組織勻漿。裂解細胞和乳腺組織，提取蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。經SDS-PAGE電泳，分離目標蛋白，轉至PVDF膜，TBST洗膜。行免疫印跡反應，封閉液封閉，加含一抗稀釋液(TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α)，4℃過夜孵育，加相應二抗，室溫搖床振蕩反應1～2h。以β-actin為內參，化學發光儀顯影，chemi capture軟件分析圖像，測定各組細胞中蛋白表達。

2 結果

2.1 瓜蔞牛蒡湯對乳腺炎細胞活力的影響 如圖1所示，與空白組相比，模型組細胞活力顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，中、高瓜蔞牛蒡湯血清組和頭孢曲松鈉組細胞活力顯著提高(P<0.05或P<0.01)，而低瓜蔞牛蒡湯血清組細胞活力無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 瓜蔞牛蒡湯對乳腺炎細胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量的影響 如圖2所示，與空白組相比，模型組IL-6、TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，中、高瓜蔞牛蒡湯血清組和頭孢曲松鈉組細胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而低瓜蔞牛蒡湯血清組則無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 各組乳腺炎細胞活力情況(n=3)

2.3 瓜蔞牛蒡湯對乳腺炎細胞TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達的影響 如圖3所示，與空白組相比，模型組細胞中TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，中、高瓜蔞牛蒡湯血清組和頭孢曲松鈉組細胞TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；而低瓜蔞牛蒡湯血清組細胞的p-NF-κB-p65/NF-κB-p65蛋白表達顯著下降(P<0.05)，TLR4、TNF-α蛋白表達則無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組乳腺炎細胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量情況(n=3)

圖3 各組乳腺炎細胞TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達情況(n=3)

2.4 瓜蔞牛蒡湯對乳腺炎組織病理變化的影響 如圖4所示，sham組小鼠組織內乳腺細胞形態正常、結構完整且未見炎性細胞，而model組組織內乳腺細胞出現腫脹、積聚。隨著瓜蔞牛蒡湯組劑量的增加，LA小鼠組織內乳腺細胞腫脹和積聚程度減輕，細胞形態趨于正常。陽性藥物組組織內乳腺細胞的改善最為顯著。

2.5 瓜蔞牛蒡湯對乳腺炎小鼠血清中IL-12、IL-10、IL-1β含量的影響 如圖5所示，與sham組相比，model組血清中IL-12、IL-1β含量顯著升高(P<0.01)，而IL-10含量顯著下降(P<0.01)。與model組相比，15、30g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組血清IL-12、IL-1β含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蔞牛蒡湯組血清IL-12、IL-1β含量無顯著差異(P>0.05)；而15、30 g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組血清IL-10含量顯著上升(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蔞牛蒡湯組血清IL-10含量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 各組小鼠乳腺組織形態(HE,×100,×200)

圖5 各組乳腺炎小鼠血清中IL-12、IL-10、IL-1β含量情況(n=3)

2.6 瓜蔞牛蒡湯對乳腺炎組織TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達的影響 如圖6所示，與sham組相比，model組組織TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達均顯著升高(P<0.01)。與model組相比，各劑量瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組組織p-NF-κB-p65/NF-κB-p65蛋白表達均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；15、30g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組組織TLR4蛋白表達顯著下降(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蔞牛蒡湯組組織TLR4蛋白表達無顯著差異(P>0.05)；30g/kg瓜蔞牛蒡湯組和陽性藥物組組織的TNF-α蛋白表達顯著下降(P<0.01)，7.5、15g/kg瓜蔞牛蒡湯組組織TNF-α蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

中醫提出治療LA應按照不同分期進行辨證治療，初期應以疏肝清胃、通乳消腫為主，主張用瓜蔞牛蒡湯行“清”之功效，積極提高中醫證候改善率[11-12]。瓜蔞牛蒡湯配方組成豐富，其中的瓜蔞、牛蒡子、金銀花、連翹、蒲公英具有清熱消癰腫功效，王不留行、皂角、陳皮可健脾活血通乳[9]。現代藥理學探索發現瓜蔞中活性成分可作用于生物過程中炎癥反應的靶點[13]，而牛蒡子苷元可介導TLR4炎癥信號抑制LPS誘導的炎性細胞因子分泌[14]。

表達于乳腺細胞表面的TLR4可由細菌特異性成分LPS激活，隨后將信號傳導至胞內觸發下游核因子κB(NF-κB)表達，產生促炎細胞因子引起組織炎癥[15]。TLR4/NF-κB信號通路激活引起炎性細胞因子異常升高是乳腺炎小鼠局部炎癥和全身免疫應答的關鍵環節[16]。既往研究結果表明，在LPS誘導小鼠后會引起乳腺組織內TLR4/NF-κB信號通路激活，組織和血清炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，而抑制TLR4/NF-κB信號通路能夠降低LA小鼠炎癥因子水平、提高抗炎細胞因子IL-10水平，減輕小鼠癥狀[17-19]。TNF-α是一種多功能型的促炎性細胞因子，其在乳腺組織高表達能夠調控炎性細胞因子生成，引起乳腺細胞凋亡和組織炎癥損傷[20]。

在本研究中，乳腺細胞及組織經LPS誘導后TLR4/NF-κB信號通路及TNF-α表達均上調，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12含量上升。而瓜蔞牛蒡湯則能抑制TLR4/NF-κB信號通路和TNF-α的表達，降低促炎性細胞因子水平，提高抗炎細胞因子IL-10水平，體現為乳腺炎細胞活力提升、乳腺炎組織淤積程度減輕，且該作用具有劑量效應。

圖6 各組乳腺炎組織中TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表達情況(n=3)

綜上所述，瓜蔞牛蒡湯改善LA的作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB、TNFα炎癥表達，繼而降低炎性因子水平有關。本研究為瓜蔞牛蒡湯臨床治療LA提供了理論依據。