橫經席不同部位提取物藥效學評價研究

黃源春 鄭志遠 呂林艷 蒙永明 梁云飛 劉 洋

橫經席不同部位提取物藥效學評價研究

黃源春1,2鄭志遠1,2呂林艷1,2蒙永明1,2梁云飛1,2劉 洋1,2

（1.廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 543000；2.廣西天然藥物現代制劑技術工程研究中心，廣西 梧州 543000）

目的：評價橫經席不同部位提取物的抗細菌性炎癥及改善脂肪肝的作用。方法：以受精后3天的斑馬魚用于橫經席樣品抗細菌性炎癥功效最大檢測濃度測定及其功效評價；以受精后5天的斑馬魚用于改善脂肪肝功效評價。結果：橫經席根莖和橫經席枝葉抗細菌性炎癥功效最大檢測濃度均為125 μg·mL-1，橫經席種子抗細菌性炎癥功效最大檢測濃度為2000 μg·mL-1；橫經席根莖和橫經席枝葉31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1及橫經席種子500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組炎癥部位中性粒細胞數量較模型對照組減少，具有統計學差異。橫經席根莖125 μg·mL-1濃度組、橫經席枝葉62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組及橫經席種子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組肝臟染色強度較模型對照組顯著降低，具有統計學差異。結論：橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子均具有抗細菌性炎癥、改善脂肪肝功效。

橫經席；提取物；斑馬魚；細菌性炎癥；脂肪肝

引言

橫經席，別名篦子王、梳篦王、薄葉紅厚殼、獨角風（《廣西中草藥》）、鐵將軍、跌打將軍、碎骨蓮、皮子黃（廣州部隊《常用中草藥手冊》），屬藤黃科胡桐屬植物薄葉胡桐（Calophyllum membranaceum Gardn. et Champ），常以根、葉入藥[1]。性味微苦、平，具有祛風濕、壯筋骨、活血止痛等功能，主產于廣西梧州、玉林、百色、南寧等地，為廣西道地藥材。橫經席主要生長于山地疏林或密林中，為木本中藥材。根、葉用于治療風濕關節痛、腰腿痛、跌打損傷、黃疸型肝炎、月經不調、痛經；葉外用治外傷出血[1]。其葉、莖、根、皮、種子等部位含有呫噸酮類（Xanthones）、香豆素類（Coumarins）、黃酮類（Flavonoids）、萜類（Terpenoids）等多種類型化合物。其葉的乙醇提取物的乙酸乙酯部分分離可得木栓酮、木栓醇、β-谷甾醇、α-香樹脂醇和3-表白樺脂酸[2]。韋健全等[3]研究表明，橫經席具有鎮痛作用，能夠有效緩解炎癥發生過程中的早期癥狀，急性毒性實驗表明，其在一定劑量范圍內應用是安全的。目前對橫經席藥用研究報道甚少，為了使這一豐富的藥用資源得到合理地開發、有效地利用，本文主要從藥理方面對橫經席的藥效學進行初步探討。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品與藥物

分別稱取橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子粉末，加入5倍量純化水提取，保持微沸30分鐘，過濾，藥渣加2～3倍量純化水繼續提取，保持微沸20分鐘，過濾，合并兩次提取液，加入涼開水定量至5倍量（藥粉），即得。用超純水配制成200 mg·mL-1母液，-20℃分裝儲存。

乙酸地塞米松，白色粉末，批號B1828095，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4℃儲存。臨用前用二甲基亞砜配制成21.7 mg·mL-1母液，-20℃避光儲存。

阿托伐他汀鈣片（以下簡稱阿托伐他汀鈣），白色片劑，批號202105219C，樂普醫療，陰涼避光儲存。用二甲基亞砜配制成11.6 mg·mL-1母液，-20℃分裝儲存。

1.2 實驗動物

斑馬魚均飼養于28℃的養魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450 μS·cm-1～550 μS·cm-1；pH為6.5～8.5；硬度為50 mg·L-1～100 mg·L-1CaCO3），由杭州環特生物科技股份有限公司養魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2022-0004，飼養管理符合國際AAALAC認證（認證編號：001458）的要求。

轉基因中性粒細胞綠色熒光斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后3天（3 dpf）的斑馬魚用于橫經席樣品抗細菌性炎癥功效最大檢測濃度（maximum test concentration，MTC）測定及其功效評價。黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后5天（5 dpf）的斑馬魚用于改善脂肪肝功效評價。

1.3 儀器、耗材與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相機（VertA1，上海土森視覺科技有限公司，China）；電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon，Japan）；顯微注射儀（IM300，Narishige，Japan）；拉針儀（PC-10，Narishige，Japan）；精密電子天平（CP214，OHAUS，USA）；6孔板（Nest Biotech，China）。

甲基纖維素（批號C2004046、B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China）；脂多糖（LPS，批號12180309，Sigma，Lsrael）；二甲基亞砜（批號BCCD8942，Sigma，Switzerland）；油紅O（批號SHBM5455，Sigma，USA）；1.2-丙二醇（批號20210817，國藥集團化學試劑有限公司，China）；純蛋黃粉（批號20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司，China）；D-(+)-葡萄糖（批號20201105，國藥集團化學試劑有限公司，China）。

2 實驗方法

2.1 抗細菌性炎癥功效評價

2.1.1 MTC測定

隨機選取3 dpf轉基因中性粒細胞綠色熒光斑馬魚于6孔板中，每孔均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子（濃度見表1），同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。除正常對照組外，其余各實驗組均卵黃囊注射給予LPS建立斑馬魚細菌性炎癥模型，28 ℃處理5 h后，測定橫經席樣品對細菌性炎癥模型斑馬魚的MTC。

表1 MTC測定所用的橫經席樣品濃度

2.1.2 抗炎功效評價

將隨機選取3 dpf轉基因中性粒細胞綠色熒光斑馬魚于6孔板中，每孔均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子（濃度見表2），陽性對照乙酸地塞米松32.6 μg·mL-1濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。除正常對照組外，其余各實驗組均卵黃囊注射給予LPS建立斑馬魚細菌性炎癥模型，28℃處理5 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，用ImageJ v1.53k軟件分析并采集數據，分析炎癥部位中性粒細胞數量，以該指標的統計學分析結果評價橫經席樣品抗細菌性炎癥功效。統計學處理結果采用mean ± SE表示。用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，＜0.05表明差異具有統計學意義。

表2 抗炎功效評價所用的橫經席樣品濃度

2.2 改善脂肪肝功效評價

隨機選取5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于燒杯中，每燒杯30尾。分別水溶給予橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子（濃度見表3），陽性對照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1，同時設置正常對照組和模型對照組，每杯容量為25 mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予高脂飼料（純蛋黃粉+葡萄糖），建立斑馬魚脂肪肝模型。28℃處理48 h后，給予油紅O進行整體脂肪染色。染色結束后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析并采集數據，分析斑馬魚肝臟染色強度，以該指標的統計學分析結果評價橫經席樣品改善脂肪肝功效。統計學處理結果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，＜0.05表明差異具有統計學意義。

表3 改善脂肪肝功效評價所用的橫經席樣品濃度

3 結果

3.1 抗細菌性炎癥功效評價

3.1.1 MTC

在本實驗條件下，橫經席根莖和橫經席枝葉抗細菌性炎癥功效MTC均為125 μg·mL-1，橫經席種子抗細菌性炎癥功效MTC為2000 μg·mL-1，詳見表4。

表4 橫經席樣品抗炎功效濃度摸索實驗結果（n = 30）

3.1.2 抗炎功效評價

LPS是一種內毒素，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成成分，當其作用于人類、大小鼠、斑馬魚或其他生物細胞時均會誘導炎癥介質的產生[4]。中性粒細胞作為免疫應答的第一道屏障，具有活躍的變形運動能力，可迅速穿出血管聚集到炎癥部位進行吞噬免疫[5]。

在本次實驗條件下，與正常對照組比較，模型對照組炎癥部位中性粒細胞數量明顯增加，具有統計學差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對照組比較，陽性藥乙酸地塞米松可以顯著減少炎癥部位中性粒細胞數量，具有統計學差異（＜0.001）；橫經席根莖和橫經席枝葉31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組炎癥部位中性粒細胞數量較模型對照組減少，均具有統計學差異（＜0.05 &＜0.001 &＜0.001），橫經席種子500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組炎癥部位中性粒細胞數量較模型對照組減少，具有統計學差異（＜0.05 &＜0.05 &＜0.001），詳見表5和圖1。

表5 橫經席樣品抗細菌性炎癥功效評價實驗結果（n = 10）

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，***＜0.001。

與正常對照組比較，###P＜0.001；與模型對照組比較， *P＜0.05，***P＜0.001

3.2 改善脂肪肝功效評價

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界上最主要的肝病病因之一，隨著肥胖癥和2型糖尿病在全球范圍內的流行，在未來幾十年中，NAFLD 可能會成為終末期肝病的主要病因[6]。肝臟作為魚類脂肪合成的主要場所，會因當天進食飼料的營養搭配而造成不同的影響，如果飼料營養搭配不當，會導致脂肪合成和代謝不平衡，致使肝臟內部脂肪大量堆積，久而久之便會形成營養性脂肪肝[7]。

油紅O是一種強脂溶劑和染脂劑，特異性與甘油三酯等中性脂肪滴結合而呈橘紅色的顯色反應，常用于甘油三酯染色和定量評價[8]。

在本實驗條件下，與正常對照組比較，模型對照組肝臟染色強度顯著增加，具有統計學差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著降低肝臟染色強度，具有統計學差異（＜0.001）；橫經席根莖125 μg·mL-1濃度組肝臟染色強度較模型對照組顯著降低，具有統計學差異（＜0.01）；橫經席枝葉62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組肝臟染色強度較模型對照組顯著降低，具有統計學差異（均＜0.001）；橫經席種子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組肝臟染色強度較模型對照組顯著降低，具有統計學差異（均＜0.01），詳見表6和圖2。

表6 橫經席樣品改善脂肪肝功效評價實驗結果（n = 10）

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，**＜0.01，***＜0.001。

與正常對照組比較，###P＜0.001；與模型對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

4 結論

本研究結果顯示，橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子均具有抗細菌性炎癥功效。三個橫經席樣品同濃度比較，抗細菌性炎癥功效情況如下：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，橫經席樣品根莖和枝葉炎癥部位中性粒細胞數量相似，無顯著差異；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，中性粒細胞數量無顯著差異，但橫經席根莖中性粒細胞數量絕對值低于橫經席枝葉；（3）在125 μg·mL-1條件下，中性粒細胞數量無顯著差異，但橫經席根莖中性粒細胞數量絕對值低于橫經席枝葉。炎癥部位中性粒細胞數量越低抗細菌性炎癥功效越佳，提示抗細菌性炎癥功效橫經席根莖最優，枝葉次之。

本研究結果顯示，橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子均具有改善脂肪肝功效。三個橫經席樣品同濃度比較，改善脂肪肝功效情況如下：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，肝臟染色強度無顯著差異，但橫經席根莖肝臟染色強度絕對值低于橫經席枝葉；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經席枝葉肝臟染色強度顯著低于橫經席根莖（＜0.01）；（3）在125 μg·mL-1條件下，橫經席枝葉肝臟染色強度顯著低于橫經席根莖（＜0.05）。肝臟染色強度越低改善脂肪肝功效越佳，提示改善脂肪肝功效橫經席枝葉最優，橫經席根莖次之。

綜上所述，橫經席藥材不同部位提取物均具有明顯的抗細菌性炎癥及改善脂肪肝的作用，其作用機制還需進一步地研究，因此對橫經席進行深入研究具有一定的理論價值和實際應用前景，一方面為橫經席防治細菌性炎癥、脂肪肝研究提供實驗基礎，另一方面為后續橫經席的資源開發及合理利用提供科學理論依據。

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Study on Pharmacodynamic Evaluation of Extracts from Different Parts of Calophylli Herba

Objective: To evaluate the antibacterial inflammation and the improvement of fatty liver with the extracts from different parts of Calophylli herba. Methods: Zebrafishes of 3 days after fertilization were used to determine the maximum test concentration of antibacterial inflammation and the evaluation of efficacy; zebrafishes of 5 days after fertilization were used to evaluate the efficacy of improving fatty liver. Results: The maximum detectable concentration of antibacterial inflammatory efficacy of rhizomes, branches and leaves of Calophylli herba is 125 μg·mL-1, while the maximum detectable concentration of antibacterial inflammatory efficacy of Calophylli herba seeds is 2000 μg·mL-1. Compared with the model control group, the number of neutrophils in inflammatory sites is decreased in the Calophylli herba rhizomes, branches and leaves of 31.2 μg·mL-1, 62.5 μg·mL-1and 125 μg·mL-1, and in the Calophylli herba seeds of 500 μg·mL-1, 1000 μg·mL-1and 2000 μg·mL-1groups, which is statistically different. The liver staining intensities in the rhizomes of Calophylli herba with 125 μg·mL-1concentration group, the branches and leaves of Calophylli herba with 62.5 μg·mL-1and 125 μg·mL-1concentration group, and the seeds of Calophylli herba with 1000 μg·mL-1and 2000 μg·mL-1concentration group are significantly lower than those of the model control group, which is statistically different. Conclusion: The rhizomes, branches and leaves of Calophylli herba and the seeds of Calophylli herba have the effect of antibacterial inflammation and the improving fatty liver.

Calophylli herba; extract; zebrafish; bacterial inflammation; fatty liver

R282

A

1008-1151(2022)12-0087-04

2022-08-14

梧州市科技計劃項目（2022A04021）。

黃源春（1989－），男，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司工程師，從事中藥及天然藥物的研究與開發工作。

劉洋（1979－），男，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司高級工程師，從事藥物研發、藥物分析研究。