2018~2021年傳染性喉氣管炎在山東商品肉雞中的發生和防控*

秦卓明，馬秀麗，亓麗紅，黃兵，高月花，劉麗萍，黃迪海，秦春芝，徐懷英**

（1.山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.山東省健牧生物藥業有限公司，山東 濟南 250100）

傳染性喉氣管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV）引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞上呼吸道，同時對眼睛、鼻竇、氣囊和肺等組織產生影響。典型癥狀為呼吸困難、氣喘，咳出帶血分泌物、眼結膜炎和眼簾腫脹等。剖檢可見喉部和氣管黏膜腫脹、出血等，嚴重的病例則具有較高的致死性，死亡率可高達40%以上。除了ILT的典型癥狀外，ILT還可以表現為溫和型，表現為黏液性氣管炎、鼻炎、眼結膜炎、眼流淚等輕微癥狀[1]。傳統認為，該病大多數發生在成年雞和產蛋雞，雛雞感染率較低。但是，近年來，1月齡內商品肉雞發生ILT的病例不斷攀升，呈現出新的發病和流行趨勢[2-3]。

ILT是世界上第一個利用疫苗成功控制的家禽疫病，變異頻率相對較低。盡管如此，ILTV屬于DNA病毒，對外界抵抗力較強，蛋、種雞等廣泛的疫苗接種，使得ILTV野毒株普遍存在，通常每隔3~5年就流行一次[4-5]。

中國ILT最早發生在貴陽（1959）。自20世紀80年代以來，該病伴隨著我國養雞業的蓬勃發展，已逐漸成為我國重要的地方流行性疫病。過去ILT的發病主要是以已開產的蛋雞和種雞為主，雛雞和育成雞較少發生。但自2018年以來，該病在我國江蘇、山東等地的商品肉雞流行普遍[6]，造成了極其嚴重的經濟損失。

1 材料和方法

1.1 發病背景

2018~2021年，山東臨沂、濰坊、棗莊等地以及江蘇連云港、徐州等地的規模化商品雞場、蛋雞場等陸續發生了一種以嚴重呼吸困難、咳血、氣管黏膜出血和充血的雞病。主要危害20~50日齡的白羽商品肉雞和地方品種雞，以30~35日齡居多。白羽肉雞的發病較多，且多數未經免疫。雞群一旦感染，則傳播速度較快，感染率在80%以上，死亡率在5%~30%，嚴重的死亡率可高達45%，幾乎無藥可治，嚴重影響雞群的生產和經濟效益。

1.2 病料處理

剖檢具有典型癥狀的發病雞或死亡雞，取其氣管黏膜或刮取黏膜黏液作為病料。病料剪碎后按1：3的比例加入滅菌的PBS溶液，反復凍融3次后，離心取上清，然后加入青、鏈霉素(2 000 U/mL) 置4 ℃冰箱過夜處理， -20 ℃保存備用。

1.3 主要試劑、材料和儀器

Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自天根生物科技有限公司；2×Premix Taq、DL2000bp DNA Marker，購自寶生物（北京）有限公司；PCR儀，購自Thermo Fisher公司；9~10日齡SPF雞胚由山東省農業科學院家禽研究所提供。

1.4 SPF雞胚接種

將無菌檢驗合格的病料經絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種10日齡SPF雞胚，每日照蛋，舍棄48 h內非特異性死亡雞胚，觀察至120 h，死亡胚和120 h活胚及時放置4 ℃冰箱并保存過夜。在生物安全柜內，觀察CAM和雞胚病變。同時將CAM剪碎研磨，加入PBS稀釋，反復凍融3次，離心取上清，置-20 ℃保存備用。取少量樣品提取核酸，進行ILTV鑒定。

1.5 病原核酸鑒定

以ILTV 的ICP4基因為模板，設計ILTV的鑒定用引物，建立相應的反應條件[7]。

1.6 gB基因序列測定

參考GenBank中ILTV經典株的結構蛋白gB基因序列，利用Prime preimer 5.0軟件設計引物，F：5’-TTCGTCTTCGCTTTCTTCTGCC-3’，R：5’-CGCGGTCCTGTATGCAATCC-3’，引物由華大基因合成。

按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取樣品的DNA，-20℃保存備用。PCR反應體系為：2×Premix Taq 25 μL，待檢DNA模板2 μL，上下游引物（10 mmol/L）各2 μL，最后用RNA-free H2O補足反應體系至50 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；進入94 ℃變性35 s， 58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 180 s，共進行33個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃結束反應。將PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，選取2 660 bp目的條帶回收后，連接pMD18-T 載體，轉化DH5α，接種LB 固體培養基培養16 h，挑取菌落進行PCR 鑒定。將陽性菌落接種LB 液體培養基增菌，送華大基因進行測序。

1.7 同源性比較和系統發育分析

從GenBank中選擇國內外的ILTV代表毒株gB核苷酸序列，利用Lasergen 7.1和MEGA5.1軟件，比較其核苷酸同源性，并采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建支原體的系統發育樹，探討不同ILTV分離株及其與疫苗株間的遺傳距離和系統演化關系。

2 結果

2.1 臨床概況

2.1.1 流行病學 山東省農業科學院家禽研究所禽病診斷中心的檢測數據表明，雞ILT在2018年以后呈現逐年增加趨勢。2018年送檢病例24例，2021年增加到103例。在送檢的疑似ILT的278份病例中，ILT的PCR陽性檢出率高達40%，如圖1。

圖1 ILT疑似送檢樣品數、陽性數以及PCR陽性檢出率

2.1.2 典型案例 自2018年10月以來，臨床報導ILT的病例逐漸增多，先是地方品種雞發病。隨后，在2020年5月~2021年4月，商品肉雞發生ILT達到高峰。表1顯示的是2018~2021年間幾次典型的ILT疫情發生概況。調查顯示，首先發生ILT疫情的商品肉雞主要集中在魯南和江蘇連云港等地，該地區蛋雞和麻雞飼養密度大，且大都曾經免疫過ILTV活疫苗。相反，同地域的大部分商品肉雞當時免疫率較低。其中，2019年，魯南地區喉痘疫苗（基因工程疫苗）的免疫率僅為30%；2020年免疫率為50%；2021年，免疫接種率攀升至90%。2021年7月后，該地區商品肉雞的ILT發病率陸續降至冰點。2022年1~9月份，未見ILT發病病例。由此可見，疫苗免疫在ILT疫情的防控方面發揮了決定性作用。

表1 典型的發病案例及其發病概況

2.2 病原分離

篩選25份不同地域、不同日齡的PCR檢測ILTV陽性雞群病料，按常規通過絨毛尿囊膜（CAM）途徑接種SPF雞胚。剖檢雞胚發現：有23份病料接種的SPF胚，其絨毛尿囊膜明顯增厚，接種部位出現典型的痘斑；且接種雞胚與SPF雞胚對照組相比，雞胚明顯發育較小，部分雞胚胚體出血，呈現出典型的ILT雞胚病變。

2.3 PCR核酸鑒定

取發生病變的CAM進行處理，利用ILTV鑒定用引物PCR擴增其ICP4基因，結果有23份有病變的雞胚分離物，其ILTV核酸PCR擴增呈陽性。相反，沒有觀察到病變的2份樣品，其ILTV核酸檢測為陰性

選取10份ILTV核酸檢測為陽性的樣品進行凝膠電泳檢測，結果如圖2。PCR產物片段大小約為570 bp，結果符合預期。對PCR產物進行序列測定，SD.JQ2020等分離株ICP4基因與美國ILTV經典雞胚疫苗株（CEO）、中國ILTV經典強毒王崗株（WG）和澳大利亞CL9毒株的同源性均為100%，證實SD.JQ2020等分離株為ILTV。

圖2 ILTV ICP4基因PCR擴增特異性鑒定結果

2.4 序列同源性分析

對ILTV 的結構蛋白gB基因的測序測定表明，其片段長度為2 652 bp。核苷酸同源性比較顯示，SD.JQ2020等分離株之間gB基因同源性為99.7%~100%；與我國廣泛使用的疫苗株K317株同源性為99.6%~100%，呈現出較高的同源性；與美國ILTV經典疫苗株CEO和TCO等同源性為99.6%~100%，也具有較高的同源性；與意大利、韓國等ILTV分離株同源性為99.6%~100%；與我國ILTV經典強毒王崗株（WG）及澳大利亞A20和VI-99等同源性為99.5%~99.8%；但與α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬MDV（JF742597）的同源性僅為33.9%。

2.5 系統發育樹

系統發育樹（圖3）表明，SD.JQ2020等分離毒株與ILTV CEO疫苗株、我國活疫苗K317株等處于同一分支，顯示出較近的親緣關系；而與我國ILTV經典強毒王崗株（WG）、4株澳大利亞ILTV分離株遺傳距離較遠，處在兩個遺傳演化關系相對較遠的分支。這表明，目前商品肉雞ILTV流行株與我國目前常用的ILTV疫苗株遺傳關系相對較近。

圖3 ILTV毒株gB基因系統發育樹

3 討論

3.1 成功從可疑ILT病料中分離出23株ILTV病毒株，確證了本次發生在商品肉雞、地方品種雞和蛋雞上的疫情為ILT。對ILTV 的結構蛋白gB基因的核苷酸同源性比較顯示，SD.JQ2020等分離株與我國目前在蛋雞、種雞和麻雞等廣泛使用的疫苗株K317株高度同源。這表明，此次疫情與臨床大量使用ILTV疫苗免疫高度相關[8-9]。無獨有偶，2008年美國商品肉雞發生的ILT，也與CEO疫苗免疫高度相關[10-11]。

3.2 針對魯南地區的ILT疫情溯源發現，此次ILT疫情的發生與魯南和蘇北地區家禽飼養模式密不可分。該地區蛋雞、麻雞飼養數量較大，且大都經過了ILTV活疫苗免疫。此外，魯南地區在2018年以后，商品肉雞經歷了高速的發展期，從事養殖的肉雞公司增多，新建立的雞場飼養規模較大，配套的一條龍企業如屠宰加工企業也較多，進而導致整個魯南地域家禽飼養密度較大，蛋雞與肉雞交互飼養，再加上蛋雞糞便、垃圾等清理不及時，導致疫苗毒擴散。此外，值得反思的還有，非洲豬瘟帶來的意外“肉雞火爆”行情，讓大多數養殖者被利潤沖昏了頭腦，盲目擴張，忽視了雞場的生物安全建設和管理。

3.3 疫苗是控制ILT發生最重要的技術手段。ILTV弱毒活疫苗包括雞胚來源疫苗（CEO）和組織來源疫苗（TCO），均屬于中等毒力，存在一定的安全隱患[12]。在4~12周齡（育成雞）免疫接種效果最佳。但一般不能對4周齡以下的雛雞接種，以免造成傷害。在實際生產中，個別養殖者忽視上述常識，對18日齡商品肉雞進行免疫接種，結果導致雞群發病。比較而言，基因工程疫苗似乎更適合于商品肉雞的免疫[13]。

常用的基因工程疫苗通常包括載體疫苗和重組疫苗。王云峰等（2001）利用雞痘病毒（FPV）為載體，成功表達ILTV中國王崗株gB基因，通過動物試驗表明該載體病毒無論對商品雞還是SPF雞的免疫保護均具有較高的保護性[14]。此外，國外有兩個成熟的商業重組ILTV疫苗，在臨床應用較廣[15]：一是由CEVA公司生產（Biomune公司），其以FPV作為載體插入ILTV的gB和UL32基因，特點是見效快，適合于商品肉雞；二是由Intervet公司生產，將ILTV的gI和gD基因克隆到火雞皰疹病毒（HVT）基因[16]，特點是維持期長，適合于蛋種雞。上述兩種疫苗均適合于胚胎接種或1日齡雛雞接種，安全系數較高。

3.4 經歷了2020~2021年的ILT疫情后，不同的家禽飼養企業加大了針對ILTV疫苗的免疫[17]。以魯南地區為例，至2021年6月份，90%以上的魯南雞場分別采用CEVA公司生產的喉痘疫苗進行了ILTV的疫苗接種。同時，各公司加大了各飼養廠區的生物安全管理[18]。具體表現在：一是強化疫苗接種；二是將雞舍空舍時間延長10 d以上，重視空舍期間的衛生消毒；三是合理布局新雞場，最大限度地規避與蛋雞場、麻雞場等不同雞場的生物安全距離；四是加強了對外來車輛的管理，禁止外來車輛進入；五是加強了對雞場糞便及其污染物的處理。通過以上綜合措施的實施，2021年7月以后的ILT疫情大幅度減少。持續的跟蹤檢測顯示，2021年10月~2022年9月，魯南地區ILT的發病幾乎為零，達到了理想的控制效果。