TiN-Ag@Ag SERS基底制備及其對腺嘌呤的檢測性能與增強機制研究

安曉潔，趙 靜，裴 媛，王志武，劉艷坤，李 波，魏穎娜，魏恒勇，吳振剛*，李景武*

（1．華北理工大學 藥學院，河北 唐山 063210；2．唐山市人民醫院，河北 唐山 063001；3．華北科技學院河北危險化學品安全與控制技術重點實驗室，河北 廊坊 065201；4．華北理工大學材料科學與工程學院，河北 唐山 063210）

表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）可通過粗糙金屬或半導體表面增強效應提升被檢測物的拉曼信號，具有快速、特異性強以及可進行單分子檢測的特點，自被發現［1-2］以來一直備受關注。SERS技術在藥物分子檢測等領域有著廣泛的應用［3］，其中腺嘌呤分子的低濃度SERS檢測對生物和醫學研究及應用有著重要意義［4］。

腺嘌呤分子是一個十分重要的生物分子，是核酸的4種核堿基之一，參與RNA和DNA合成，也是生命能量物質ATP的重要組成部分。DNA分子的SERS信號中腺嘌呤為主導信號，對腺嘌呤的SERS進行檢測是檢測DNA的有效分析手段［5］。此外，體內腺嘌呤含量的變化可能會引起肺癌的發生，因此體內腺嘌呤的含量也可視為早期肺癌的重要判斷依據。湯釗［6］以抗壞血酸為還原劑制備銀溶膠，并以其為增強基底對腺嘌呤水溶液及尿液樣進行了SERS檢測，發現銀溶膠表現出SERS增強效果。

銀溶膠是目前SERS基底的常用材料之一，陳志杰等［7］使用銀溶膠為SERS基底對水和尿液中的舒芬太尼進行了檢測。但由于銀的化學性質不穩定，導致SERS檢測的應用范圍受限［8］。氮化鈦（TiN）的熱穩定性、化學穩定性以及生物兼容性優異，同時展現出良好的SERS性能［9］。基于此制備貴金屬∕氮化鈦復合基底，可改善貴金屬材料的穩定性和生物相容性，并提升基底的SERS活性。Ban等［10］通過制備TiN-Ag復合基底，利用Ag與TiN之間的電荷轉移和較強的局部電磁場耦合效應，大幅提高了基底的SERS靈敏度，同時基底的耐久性也得到了改善。Liu等［11］制備的Ag∕Au∕TiN復合薄膜憑借Ag∕Au∕TiN三者的耦合效應，使得基底的SERS效應顯著增強。Wang等［12］制備的Au@TiNx納米結構也表現出拉曼散射增強效果。Ma等［13］通過在包裹Ag的TiN基底上組裝Au納米顆粒，借助Ag、TiN和Au之間的協同作用實現了良好的表面增強拉曼效果。利用貴金屬和TiN材料良好的協同耦合作用開發高性能的SERS基底，探討其在生物醫藥領域的應用成為當前的研究熱點之一。

本文采用電沉積及自組裝法制備了TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶膠3種復合SERS基底，探討了3種基底對腺嘌呤的拉曼檢測性能，并分析了其拉曼增強機制。

1 實驗部分

1.1 試 劑

四氯化鈦（TiCl4）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，130 × 104）以及腺嘌呤均購自上海阿拉丁試劑網；無水乙醇購自天津市興復精細化工研究所；硝酸銀（AgNO3）、檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；氨氣（99．99%）和氮氣（99．99%）購自唐山市路北區萬嘉氣體經銷處。

1.2 SERS基底的制備

參考文獻［11］制備TiN薄膜與Ag溶膠。TiN薄膜制備：取6 mL四氯化鈦乙醇溶液，加入10 mL無水乙醇，2．5 mL DMF，1 g PVP，攪拌溶解。隨后以勻膠儀石英基片鍍膜，時間為20 s，轉速為3 500 r∕min。于烘箱80 ℃干燥24 h后，600 ℃下預燒，保溫30 min得到TiO2膜。將TiO2膜放入管式爐，以5 ℃∕min的速度升溫至1 000 ℃，之后通入800 mL∕min的NH3，保溫2 h，得到TiN薄膜。

Ag溶膠制備：取AgNO30．018 g加至100 mL去離子水中溶解，在水浴中加熱攪拌至沸騰。當溫度達到100 ℃時，滴加2 mL 0．1 g∕mL的檸檬酸鈉，反應1 h得到黃綠色的Ag溶膠溶液。

TiN-Ag薄膜基底制備：取0．016 9 g AgNO3溶解于20 mL去離子水中，得到濃度為5 mmol∕L的AgNO3沉積液。以TiN薄膜基底為工作電極，金屬Pt為對電極，電壓為5 V，沉積時間為5 min，制備TiN-Ag薄膜基底。

TiN@Ag溶膠基底制備：將Ag溶膠在8 000 r∕min下離心10 min，除去上清液，將得到的下層液體與樣品混合均勻滴加在TiN薄膜表面，即得到TiN@Ag溶膠基底。

TiN-Ag@Ag溶膠基底制備：將Ag溶膠在8 000 r∕min下離心10 min，除去上清液，將得到的下層液體與樣品混合均勻滴加在TiN-Ag薄膜的表面，即得到TiN-Ag@Ag溶膠基底。

1.3 SERS檢測與表征

將腺嘌呤溶于去離子水中配制成不同濃度的溶液，滴加在TiN-Ag基底或與Ag溶膠1∶1混勻滴加在TiN和TiN-Ag基底上。采用DXR激光拉曼光譜儀（美國熱電公司）在激發波長為633 nm，功率為1 mW，物鏡為10 ×，采集時間為10 s的條件下進行SERS檢測，對每個樣品進行打點數據收集，點數為8。

采用JEM-2800F透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）觀測所合成Ag溶膠的形貌；利用Zetasizer Nano ZS90納米粒度分析儀（英國馬爾文公司）測定Ag溶膠的粒徑分布；借助D∕MAX2500PC X射線衍射儀（XRD，日本理學株式會社）和S-4800場發射掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立株式會社）分析基底物相組成和微觀形貌；采用Lambda 750S紫外-可見分光光度計（美國Perkinelmer公司）測試樣品的吸收曲線；利用Thermo 250X紫外光電子能譜（美國Thermo Fisher Scientific公司）測試薄膜的功函數和價帶導帶位置。

2 結果與討論

2.1 TiN-Ag@Ag溶膠復合SERS基底的表征

利用透射電子顯微鏡觀察Ag溶膠的顆粒形貌，結果顯示合成的Ag溶膠納米顆粒呈準球形，粒徑為50 ～ 100 nm，其衍射環明顯，表明合成的Ag溶膠為金屬Ag單質（圖1A）。同時在高分辨率圖像中觀察到其晶格邊緣間距為0．23 nm（圖1B），與單質Ag晶體的（111）晶面相對應。利用紫外-可見分光光度計表征其等離子共振吸收峰，發現在419 nm附近出現了Ag納米顆粒的等離子體共振吸收峰［14-15］。以上結果表明，檸檬酸鈉將硝酸銀還原成Ag單質納米粒子。

圖1 Ag溶膠的TEM圖（A ～ B）及其UV-Vis光譜（C）Fig．1 TEM images of Ag sol（A-B） and its’UV-Vis spectrum（C）

對TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶膠3種復合基底進行XRD測試，結果如圖2A所示。XRD圖表明，TiN的（111）和（200）衍射峰分別出 現 在36．9°和42．9°。單 質Ag晶 體 的（111）、（200）、（220）和（311）衍射峰分別出現在38．2°、44．4°、64．6°和77．4°。在TiN-Ag@Ag溶 膠 的XRD圖譜中，Ag單質（111）的特征衍射峰越來越尖銳，表明越來越多的Ag單質聚集在TiN表面，并優先沿（111）面擇優生長。圖2B則顯示了3種基底的UV-Vis圖，如圖所示，400 ～ 600 nm處出現了共振吸收峰，與a和b相比，曲線c的吸收峰位置有紅移，表明Ag聚集在TiN表面，Ag和TiN之間存在共振耦合。

圖2 TiN@Ag溶膠（a）、TiN-Ag薄膜（b）、TiN-Ag@Ag溶膠（c）基底的XRD圖（A）和UV-Vis圖（B）Fig．2 XRD spectra（A） and UV-Vis spectra（B） of TiN@Ag sol（a），TiN-Ag film（b），TiN-Ag@Ag sol（c）

TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄 膜 和TiN-Ag@Ag溶膠的SEM形貌如圖3所示。圖3A顯示，少量的Ag納米粒子聚集在TiN薄膜的表面上。而TiN薄膜上沉積Ag后，其表面出現Ag納米棒，并呈現出樹枝狀的結構（圖3B）。圖3C表明TiN-Ag基底上復合Ag溶膠后，Ag納米粒子分布在TiN薄膜表面沉積的Ag納米棒周圍。

圖3 TiN@Ag溶膠（A）、TiN-Ag薄膜（B）、TiN-Ag@Ag溶膠（C）的SEM圖Fig．3 SEM diagrams of TiN@Ag sol（A），TiN-Ag film（B） and TiN-Ag@Ag sol（C）

2.2 腺嘌呤理論圖譜與拉曼檢測

通過Gaussian軟件利用密度泛函理論（DFT）優化了腺嘌呤的結構并計算了其理論拉曼圖譜，如圖4所示。對腺嘌呤粉體進行常規拉曼（NRS）測試，并以TiN-Ag薄膜為SERS基底，對0．01 mol∕L的腺嘌呤溶液進行SERS檢測，結果如圖5所示。可以看出，與理論拉曼圖譜相比，腺嘌呤的常規拉曼譜、SERS圖譜中的部分拉曼峰位發生了偏移，但其基本特征峰較為吻合，主要特征峰歸屬見表1。造成峰位偏移的原因可能是腺嘌呤吸附在增強基底上時分子的構型和偶極距發生了改變，也可能是理論計算中過多的電子以及外部溶劑的參與造成。

表1 腺嘌呤的DFT、NRS和SERS光譜歸屬Table 1 DFT，NRS and SERS spectral attribution of adenine

圖4 DFT優化的腺嘌呤結構（A）及其理論拉曼圖譜（B）Fig．4 DFT-optimized adenine structure（A） and its theoretical Raman atlas（B）

圖5 腺嘌呤的常規拉曼圖譜（A，粉體）及SERS圖譜（B，溶液）Fig．5 Conventional Raman atlas（A，powder） and SERS atlas（B，solution） of adenine

2.3 不同基底對腺嘌呤的SERS檢測性能分析

將0．01 mol∕L的腺嘌呤溶液（0．013 5 g，10 mL去離子水）分別吸附在TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜和TiN-Ag@Ag溶膠3種基底上，研究不同基底對腺嘌呤的拉曼增強性能。圖6A顯示，TiN-Ag薄膜基底的拉曼增強性能優于在TiN@Ag溶膠基底；與另兩種基底相比，TiN-Ag@Ag溶膠作為基底的拉曼性能增強效果最強。圖6B顯示了腺嘌呤在不同基底上于740 cm-1和1 330 cm-1處的信號峰強度，可以看出其在TiN-Ag@Ag溶膠基底上特征峰的拉曼強度最高。

圖6 不同基底上腺嘌呤的SERS光譜（A）及其特征峰的拉曼強度（B）Fig．6 SERS spectra of adenine on different substrates（A） and adenine characteristic peak Raman intensity（B）

將腺嘌呤配成10-2、10-3、10-4、10-5mol∕L濃度梯度的溶液，以TiN-Ag@Ag溶膠為基底測試其SERS檢出限，結果見圖7。可以看出，隨著腺嘌呤溶液濃度的遞降，腺嘌呤的SERS信號強度呈現降低的趨勢。以腺嘌呤的溶液濃度（X）與相對應的728 cm-1處的拉曼強度（Y）取對數之后繪制標準曲線，得到Y =0．408X +3．843，相關系數（r2）為0．989 5。從圖中可以看出，當溶液濃度低至10-5mol∕L時，仍可觀察到728 cm-1處特征峰的拉曼信號，因此腺嘌呤在TiN-Ag@Ag溶膠基底上的檢出限可達10-5mol∕L。說明該基底適用性尚可，且靈敏度較高。與其他Ag納米基底［16］相比，本文基底制備過程簡單，TiN薄膜基底機械性能好且穩定［17］，在空氣中放置兩周仍可有較好的拉曼增強效應，具有一定的應用前景。

圖7 不同濃度腺嘌呤在TiN-Ag@Ag溶膠基底上的SERS圖譜Fig．7 SERS spectra of different concentrations of adenine on the TiN-Ag@Ag sol substrate

2.4 SERS增強機制分析

測定了TiN薄膜的紫外光電子光譜（UPS）（圖8），確定TiN的UPS寬度為14．05 eV（16．55-2．50），TiN-Ag復合 后的UPS寬 度為13．26 eV（16．68-3．42）。通過將激發能（21．22 eV）與UPS光譜的寬度相減，估計出TiN基底的VB位于-7．17 eV，并得到功函數Φ為-4．67 eV，由于功函數為真空能級減去費米能級后得到的值，由此可知其費米能級位置。同理得到TiN-Ag復合后的功 函 數 為-4．54 eV。TiN薄 膜 的 禁 帶 寬 度［18］為2．73 eV，利用ECB帶=EVB-Eg（ECB、EVB、Eg分別代表半導體材料的導帶電勢、價帶電勢和禁帶寬度），得到TiN的CB位于-4．44 eV。結合高斯軟件中密度泛函理論計算腺嘌呤的LUMO和HOMO位置，得到其LUMO和HOMO分別為-0．99 eV和-6．34 eV。由圖9可知，電荷可以很好地從Ag轉移到TiN中，直至二者的軌道能級差相同，由于轉移過程，TiN-Ag界面內會產生電荷積累和一定的電勢，這對局部電磁場效應非常有利，因此，TiN-Ag復合后的基底拉曼性能提高，由于復合基底與腺嘌呤分子之間也存在電荷轉移，故腺嘌呤的拉曼信號更為增強。此外，當藥物的HOMO和LUMO位置與腺嘌呤相似時，則基底與分析物分子之間同樣存在電荷轉移，如使用此基底對對乙酰氨基苯酚、茶堿、布洛芬、恩諾沙星等藥物進行SERS檢測也可以得到很好的SERS增強效應。

圖8 TiN（A）和TiN-Ag（B）的UPS光譜Fig．8 UPS spectra of TiN（A） and TiN-Ag（B）

圖9 TiN-Ag復合基底與腺嘌呤之間的電荷轉移示意圖Fig．9 Schematic diagram of charge transfer between TiN-Ag composite substrate and adenine

為對Ag溶膠、TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶膠基底的電場分布以及SERS增強機制進一步分析，選擇400 ～ 700 nm波長的光沿著y軸方向射入，利用時域有限分差法（FDTD）對基底進行模擬，結果如圖10所示。比較Ag溶膠基底與TiN@Ag溶膠發現，TiN薄膜上復合Ag溶膠納米粒子后，在TiN薄膜與Ag納米顆粒的結合處出現明顯的“熱點”，提高了局域電場強度（圖10A ～ B）。TiN-Ag薄膜基底（圖10C）比TiN@Ag溶膠基底的電場強度強，是因為TiN薄膜與Ag納米棒的結合產生了明顯的表面等離子體耦合效應。從圖10D可以看到，在TiN-Ag薄膜上復合Ag溶膠后，使得基底的電場強度增強效應更為顯著，可能是因為TiN-Ag@Ag溶膠基底上除了具有TiN薄膜與Ag納米顆粒發生共振耦合作用明顯出現的“熱點”外，還具有Ag納米顆粒聚集在Ag納米棒之間形成的納米間隙提供的更多“熱點”，而“熱點”位置具有更強的表面等離子體共振效應，“熱點”越多增強效應越好，最終使得該基底的SERS活性增強最為顯著［19-20］。

圖10 不同基底的2D-FDTD模擬圖Fig．10 2D-FDTD simulation diagrams of different substrates

3 結 論

本研究成功制備了TiN@Ag溶膠、TiN-Ag薄膜及TiN-Ag@Ag溶膠3種復合基底，結果顯示納米Ag均勻分布在TiN表面，Ag和TiN之間存在共振耦合作用。利用UPS和FDTD對基底的增強機制進行分析，發現TiN-Ag@Ag溶膠基底的電場強度明顯比另外兩種基底更強，該基底除了具有TiN薄膜與Ag納米顆粒發生共振耦合作用明顯出現的“熱點”外，還具有因Ag納米顆粒聚集在Ag納米棒之間形成納米間隙而提供的更多“熱點”，而“熱點”位置具有更強的表面等離子體共振效應，同時存在電荷轉移，使得SERS活性明顯提高。利用該復合基底對腺嘌呤溶液進行SERS檢測，檢出限可達10-5mol∕L。