近紅外光譜用于注射用復方甘草酸苷質量控制研究

汪義程，郭志永，閆 宇，薛洪寶，*，陳 鵬，宮文武

（1．蚌埠醫學院 公共基礎學院，安徽 蚌埠 233030；2．安徽宏業藥業有限公司 生產技術部，安徽 蚌埠 233045；3．安徽省藥品監督管理局第五分局，安徽 蚌埠 233000）

近紅外光的發現已有兩百余年的歷史，隨著科技的發展和時代的進步，近紅外光譜（Near infrared spectrum，NIRS）分析技術在許多行業中均發揮著重要作用，特別是在藥物分析領域中的應用較為廣泛［1-2］。NIRS在制藥行業中可用于不同狀態和不同類型的藥物分析，包括原料藥純度檢測、包裝材料質量的監測以及對藥品加工全過程和生產工藝進行在線連續分析、監控，還可對藥物流通中的劣藥、假藥進行鑒別和成分分析。特別是對于一些成分含量較為復雜的藥品，使用傳統的化學方法進行藥品分析時程序繁多且耗時長，而近紅外分析技術可根據藥物特性進行定性或定量分析，大大提高分析效率。

藥品生產時的工序一般較為復雜，要歷經混合、加工、成型和包裝等步驟才能完成生產，而要對藥品生產過程中的質量進行有效的控制，需在藥品加工全過程對所有組分進行全面、系統地檢測和分析［3］，這種檢測方法速度慢，效率低，不利于提高企業的經濟效益。近紅外光主要是C—H、O—H、N—H、S—H等含氫基團振動光譜倍頻及合頻等的吸收光譜，譜帶上不同基團的近紅外吸收不同，有機化合物的結構、組成信息可在譜圖中進行顯示［4-5］。近紅外光譜分析技術是對標準樣品的光譜進行采集后，運用合適的算法計算，并建立檢驗分析模型，同時進行相關性驗證。當檢測樣品時，用被檢測樣品的圖譜與標準模型進行比對和分析，可得到檢測結果。近紅外光譜具有便捷、無損檢測、測量及結果傳遞快等特點［6］，避免了液相色譜法和氣相色譜法樣品預處理復雜、檢測時間長、成本高等問題，適合在大規模生產的情況下對藥品的質量進行全面監控，其在制藥領域的應用前景光明，發展潛力巨大［7］。

本研究通過采集某公司注射用復方甘草酸苷產品70批次的近紅外光譜圖，基于其中甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸3種組分的含量數據，建立了可快速、準確預測這3種組分含量的近紅外定量分析模型，優化了模型［8］并進行了可靠性驗證。該方法為復方甘草酸苷的質量控制提供了一種參考方法，有望作為生產過程中產品質量控制的輔助手段，實現產品質量監測的全覆蓋，最大限度降低產品質量風險，為醫藥生產企業創造較高的間接經濟效益。

1 實驗部分

1.1 儀器及樣品

Thermo Antaris Ⅱ近紅外光譜儀（鹵鎢燈光源）；Agilent Technologies分析型高效液相色譜儀（HPLC，1260 Infinity Ⅲ Prime）；Origin8．0專業函數繪圖軟件、TQ Analyst光譜分析軟件、SPSS數據統計分析軟件。

樣品為注射用復方甘草酸苷（標示含量規格（參考值）：每瓶含甘草酸苷40 mg，甘氨酸400 mg，鹽酸半胱氨酸20 mg）凍干粉針劑，由10 mL中性硼硅玻璃管制西林瓶包裝。

1.2 樣品分組

將采集的70批次注射用復方甘草酸苷樣品的近紅外光譜圖及其中甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸3種組分的含量數據作為樣品集，按照校正集與驗證集樣品比例4∶1建立分析模型；同時在保證驗證集樣品含量在校正集樣品含量范圍內的前提下，選擇校正集樣品和驗證集樣品。最終從70批次樣品集中選取13批次作為驗證集。校正集樣品中甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸的含量分布范圍分別為：0．23% ～ 4．0%、0．40% ～ 5．1%、0．10% ～ 3．9%；驗證集中相應為：0．25% ～ 7．2%、0．05% ～ 0．65%、0．05% ～ 1．8%。實驗數據處理流程見圖1。

圖1 實驗數據處理流程圖Fig．1 The processing chart of experimental data

2 結果與討論

2.1 近紅外光譜的采集及譜段選擇

采用積分球漫反射采樣模塊直接掃描測定樣品的NIRS圖譜。光譜采集條件：以儀器內置空白背景為參比，用近紅外光譜儀采集所有NIRS及CSV格式的數據矩陣；波長范圍10 000 ～ 4 000 cm-1，掃描累加次數32次，分辨率8 cm-1；分別測定各批樣品，得到3種組分的原始光譜圖（圖2A），其一階和二階導數光譜圖見圖2B、C。由圖2可見，復方甘草酸苷中3種組分的譜圖在9 000 ～ 8 200 cm-1和6 700 ～5 000 cm-1范圍內存在較大差異。最終選擇8 928．80 ～ 8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～ 8 411．80 cm-1譜段建立3種組分的定量分析模型。

2.2 模型評價及預處理

分別從每個批次的樣品中隨機選取2組數據，共得到140個紅外光譜圖作為建模分析用樣本，建立注射用復方甘草酸苷的偏最小二乘回歸（PLS）［8］定量分析模型。

2.2.1 模型評價以70批次樣品為標準樣品，隨機選取兩組樣品作為驗證樣品進行分析，將分析結果與標準值進行比較，根據窗口中模型參數選擇，計算其指標特征。其中相關系數（R）反映預測值與參考值的相關性，該值越高則相關性越高；校正均方根誤差（RMSEC）、預測均方根誤差（RMSEP）作為評價所建定量模型性能的指標，其結果越接近0，說明模型適用性越強，預測結果越準確。根據以上數值對模型的預測效果進行綜合評價。

2.2.2 預處理方法的選擇光譜預處理方法有平滑、位移校正、導數校正、小波變換等，合適的光譜預處理方法可以有效消除物理因素的干擾，提高NIRS與待測化學成分的相關性。不同預處理方法結合使用有望得到更好的模型效果［9］，本研究發現，樣品光譜經過一階導數+S-G（3，3）點平滑處理后，不僅能有效消除光譜漂移和噪音，且8 928．80 ～8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～8 411．80 cm-1譜段內的曲線波動明顯，數據變異性增強，能夠最大限度地體現不同品種光譜的差別。以該譜段作為特征區間，考察了全譜段與特征區間譜段的建模效果。由表1可知，一階導數分別結合S-G（3，5）、S-G（3，4）、S-G（3，3）、S-G（3，2）、S-G（3，1）點平滑處理時的結果一致，為減小實驗誤差，確保模型的準確性和可靠性，取中間的S-G（3，3）點平滑結合一階導數作為預處理方法。

2.3 建模結果及模型驗證

2.3.1 建模結果通過優化譜段和選擇不同預處理方法，并結合軟件自帶的光譜離群值剔除功能，剔除影響模型建立的樣本［8］，確定最終的建模參數為：譜圖預處理選擇一階導數+S-G（3，3）平滑，譜段分別選擇8 928．80 ～ 8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～ 8 411．80 cm-1，通過RMSEC對主因子作圖優化模型參數，分別得到甘氨酸、甘草酸苷，鹽酸半胱氨酸3種組分模型的最佳主因子數為10、3、10，模型相關系數（R）分別為0．999 54、0．947 01、0．999 95，RMSEC依次為0．289、0．098 0、0．001 07（表1）。相關系數值均接近1，表明預測值與參考值之間存在良好的相關性；均方根誤差較小，表明預測值與參考值之間產生的誤差較小。而模型相關系數0．947 01數值偏離1，可能原因如下：其一，受近紅外檢測限的影響。國際公認檢測限為0．1%，若樣品濃度低于該閾值，將導致近紅外模型預測誤差較大；其二，受建模樣本代表性及數量的影響。理論上，建模樣本數量越多，統計模型可靠性越高，若建模樣本缺乏代表性，將導致化學性質僅分布在一個很小的區間內，使得該模型不具備廣泛代表性。

2.3.2 模型驗證為確認所建立的定量模型能適應所測樣品，并能對實際樣品進行準確預測，使用驗證集中的13批樣品對所建立的模型進行驗證。使用驗證集的相關系數（R）和均方根誤差對模型性能進行評估［9］。3種組分驗證集的R分別為0．999 34、0．949 00、0．989 23，RMSEP分別為1．86、0．302、0．191，預測值分別為397．396 2、19．810 0、40．210 8。將模型預測值與參考值進行比較，結果顯示，甘氨酸、甘草酸苷、鹽酸半胱氨酸的預測值與參考值之間的平均相對誤差分別為0．41%、0．72%、0．86%，且預測值與參考值在95%置信區間內無顯著性差異（P＞ 0．05）。

以未用于建模的16批注射用復方甘草酸苷樣品及1份不合格樣品作為對照，分別掃描其近紅外光譜圖，利用所建模型預測其中3種成分的含量，表2為NIRS預測值與測定值的比較。測定值為各成分的實際含量［10］，其中，鹽酸半胱氨酸的檢測方法為高效液相色譜法，甘草酸苷為硫代硫酸鈉滴定法，甘氨酸為氫氧化鈉滴定法。由表2可知，測定值間的全譜段匹配度平均值為：鹽酸半胱氨酸99．19%、甘草酸苷99．73%、甘氨酸為98．64%；區段譜圖匹配度平均值為：鹽酸半胱氨酸為95．28%、甘草酸苷為99．81%、甘氨酸為99．63%；平均誤差率：鹽酸半胱氨酸為-0．37%、甘草酸苷為2．14%、甘氨酸為0．37%。結果表明，NIRS預測值與測定值間無顯著性差異，說明所建立的模型可用于注射用復方甘草酸苷的快速測定［11-13］。

表2 模型預測值與測定值的比較Table 2 Comparison of predicted values and measurement values

由3種成分的全譜圖匹配度和區段譜圖匹配度可知，所建模型具有一定的精密度和準確度，16批樣品的個體誤差率值較小，均在± 5%以內，平均誤差率在± 2．5%以內，說明預測結果的可靠性和穩定性均較高。不合格對照組中鹽酸半胱氨酸和甘草酸苷誤差率為3．13%和3．76%，相對較高，但符合要求；而甘氨酸的誤差率為6．13%，超出5%范圍，定量分析結果不符合要求。由此可見本定量分析方法模型穩定、可靠、精密、準確，可作為醫藥生產企業對注射用復方甘草酸苷質量控制的有效輔助質量控制手段。

2.4 討 論

以某公司注射用復方甘草酸苷產品70批次的質量檢驗數據為基礎建立數學模型，由于數據采集的時間跨度較大，儀器穩定性、溫度、濕度、樣品含水量、pH值等外部因素存在差異，可能會導致實驗數據存在差異，使得后期建模過程存在一些問題。因此，應盡量在短時間內采集數據，保證數據的準確性和精度。原始光譜是模型建立的基礎，標準樣品組分含量測定的準確性和精度是影響NIRS定量分析準確度的最主要因素。光譜采集和數據記錄的準確性也決定了模型的真實性［14］。其次，建立定量分析鑒別模型是利用樣品的圖譜庫，因此樣本的代表性受圖譜庫大小的影響，并決定了模型的準確性。一般要求建模的樣品量不少于50批，以降低樣品預測誤差。

通過選擇光程類型、導數處理、濾噪、平滑和基線校正等對光譜進行預處理，可以提高模型的穩健性。建模過程中，光譜范圍的選擇對模型的建立至關重要，可避免其它信息對有效光譜信息的干擾，不同建模波段下模型的性能結果（圖2）顯示，選擇8 928．80 ～ 8 776．70 cm-1、6 520．77 ～ 5 134．44 cm-1和8 921．02 ～ 8 411．80 cm-1譜段得到的3種組分的定量分析模型整體性能較好。因此要根據長期積累的經驗和對所分析樣品化學性質的了解選擇合適的譜段建立模型，確保模型的準確性和專屬性［15］。

NIRS定量分析模型的建立是一個反復循環優化的復雜過程，需要不斷地檢查造成模型精度不合格的原因，并反復進行分析和排除，直至驗證結果滿意。在模型的反復優化過程中，可選擇相關系數（R）和均方根誤差（RMSE）作為評價指標對模型的效果進行驗證和評估［16］。

3 結 論

本研究建立了注射用復方甘草酸苷中3種組分的定量分析模型，結果顯示，該3種組分的預測值與測定值之間存在良好的相關性，所建模型穩定、可靠，能有效地對未知樣品成分進行含量預測。通過近紅外光譜技術不僅可實現注射用復方甘草酸苷凍干粉針劑生產過程的實時監控，還可簡化其檢驗工序，進一步提升檢驗精確度，保障注射用復方甘草酸苷凍干粉針劑的質量。