指紋圖譜技術在重樓質量控制中的應用

柯昌虎，馮協和，潘長江，李志浩

(1.湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院，湖北 十堰 442008； 2.湖北醫藥學院藥學院，湖北 十堰 442000)

0 引 言

重樓(Paridis Rhizoma)為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖[1]，是我國重要的藥用資源，是云南白藥系列藥等200余種中成藥的主要成分之一[2]，含有甾體皂苷、三萜、黃酮等成分[3-6]，具有抗腫瘤[4]、抗氧化[7]、抗菌[8]、抗炎[9]、抗衰老[10]等多重藥理作用，對多種疾病均有療效。重樓為多年生草本植物，資源再生緩慢，人工種植尚不能滿足市場需求。大量非藥典規定的重樓植物基源品種的產品充斥商品市場，不同產地、不同采收期的重樓品質差異大[11]，質量參差不齊，常規的鑒別手段難以將其區分出來。

指紋圖譜是一種可以鑒別中藥材真偽、評價中藥質量優劣、區分物種屬性和確保其一致性和穩定性的綜合性分析技術[12]，具備專屬性強、穩定性好、重現性高等指紋特性，可以描述出中藥復雜體系的整體特征，反映出復雜組分之間的相互作用，體現出不同產地、不同采收時期、不同批次中藥的共同特點和特異性，量化分析出中藥多層次的宏觀質量信息，在多組分定量、質量控制、活性成分篩選、指紋功效關系研究等方面的應用優勢明顯[13-14]，可為中藥材、中成藥、中藥制劑等提供一種綜合性和可量化的質量評價方法，并收錄于2020版《中國藥典》一部中。本研究就指紋圖譜在重樓中的研究成果進行綜述。

1 色譜指紋圖譜

1.1 高效液相色譜

高效液相色譜(HPLC)兼有定性和定量作用，廣泛應用于中藥材質量分析及控制中，選擇性好，重現性和靈敏度高，應用覆蓋廣，且色譜柱能夠反復多次利用，已成為指紋圖譜中使用較多的方法之一[15]。中藥HPLC可根據不同藥物成分的特點選擇色譜條件，搭配不同的色譜柱和檢測器，實現藥材產地、優劣、真偽的區分與鑒別。

羅廷順等[16]采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱，以乙腈-水為流動相，對10個來自云南各州市縣重樓藥材進行HPLC法分析。指紋圖譜中標定出13個共有峰，指認出8、9、10和S號峰分別為重樓皂苷VII、VI、II、I，圖譜相似度為0.851～0.970，表明產地不同的重樓主成分具有良好的一致性。吳鈺穎等[17]采用HPLC法對產自大理的重樓進行分析，色譜柱為Thermore C18，流動相為乙腈-水，建立了10個產區的多葉重樓和11個不同產地云南重樓根莖HPLC指紋圖譜，共有峰分別為14個、13個，圖譜相似度分別大于0.900、0.922。多葉重樓和云南重樓的根莖圖譜有11個共有峰，但相似度僅為0.057～0.225，7種主要甾體皂苷成分存在較大差異，多葉重樓中重樓皂苷I、II、VI和VII的含量低于云南重樓。袁會瓊等[18]采用Agilent Zorbax-SB C18色譜柱，以乙腈-水為流動相，對10批云南重樓和10批長柱重樓進行HPLC分析，共發現15個共有峰，指認出6、7、8、9號峰分別為重樓皂苷VI、VII、II、I，且長柱重樓中上述4種有效成分的含量明顯高于云南重樓，圖譜相似度分別為0.905～0.998和0.905～0.986，聚類分析(CA)結合主成分分析(PCA)顯示20批樣品被顯著地分成2類，可為其品種鑒定及質量監控提供參考。錢正明等[19]采用Welch Ultimate AQ-C18色譜柱，以水-乙腈為流動相，對10批重樓樣品HPLC分析，圖譜中標記出16個共有峰，相似度多小于0.900，CA和PCA結果顯示10批重樓聚為3類，表明重樓藥材化學成分存在差異。

1.2 超高效液相色譜

與HPLC相比，超高效液相色譜(UPLC)柱效更高，具有更強的分析效率、靈敏度及分離能力，與不同檢測器聯用，適合于不同類型藥物復雜體系的分析鑒定，結合指紋圖譜技術在中藥質量評價中具有的獨特優勢，目前對于中藥重樓的研究主要集中于甾體皂苷類成分[20-21]。

趙飛亞等[22]采用UPLC法對10種不同產地重樓進行分析，色譜柱為Luna Omega Polar C18，流動相為乙腈-水，測定了55批藥材中重樓皂苷I、II、VI、VII、H和薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷的含量，并采用TOPSIS模型分析，發現重樓化學綜合質量差異較大。高妍等[23]采用UPLC法對云南重樓、華重樓、偽品三者進行分析，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3，流動相為乙腈-水，在10批云南重樓圖譜中標定出偽原纖細薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、薯蕷皂苷及重樓皂苷VII、H、II、I、V共8個特征峰，10批云南重樓、3批華重樓的相似度分別為0.70～0.83、0.26～0.37，7批偽品圖譜相似度小于0.22，CA和PCA均能使三者得以區分。張紹山等[24]對23份云南重樓及多芽品系進行UPLC分析，色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18，流動相為乙腈-水，建立了10批樣品的UPLC指紋圖譜，標定出8個共有峰，指認出重樓皂苷VII、H、II、I 4個特征峰，重樓(多芽品系)樣品間相似度小于0.9，CA和PCA分析從整體上表明樣品成分及含量具有明顯差異。楊遠貴[25]采用UPLC法對38批不同種重樓進行分析，色譜柱為Shim-pack XR-ODS III column，流動相為乙腈-0.05%甲酸水，定量分析出重樓皂苷I、II的含量差異，并結合PCA、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，結果顯示，大部分重樓樣品的含量比(重樓皂苷II/重樓皂苷I)小于100%，6種不同重樓很好聚為兩類，其中滇重樓和五指蓮UPLC指紋圖譜中共有峰個數分別為32個、25個，相似度分別大于0.80、0.82，對重樓進行質量評價可為尋找滇重樓種源替代產品提供參考。

1.3 薄層色譜

薄層色譜(TLC)常用于鑒別、雜質檢查或含量測定，在中藥的質量控制中起著重要的作用，展開速率快，分辨能力強，展開劑和展開方向可隨用隨換，操作簡便易行。隨著高效薄層色譜(HPTLC)的出現，將常量薄層色譜的靈敏度和分辨力大大提高，方法更加高效、快速、可靠，可提供色譜指紋圖譜的電子圖像和密度圖來檢測植物樣品中是否存在標記化合物[26]。

洪淑華[27]采用預制硅膠G薄層板，展開劑為氯仿-甲醇-水(15∶5∶1)的下層溶液，點樣量2 μL，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱，365 nm紫外燈和日光下檢視，對9個重樓商品藥材和10個自然保護區來源重樓樣品進行分析并建立TLC指紋圖譜，以重樓皂苷I、II為指標成分，發現來源不同的重樓樣品的品質參差不齊；CA顯示，9個商品藥材劃分為5個類群，品質與來源不相一致，品種較為混亂，10個自然保護區樣品劃分為4個類群，與實際情況一致。于新蘭等[28]采用G薄層板，展開劑選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(17∶40∶21∶10)10℃以下放置的下層溶液，檢視后可見23個熒光條斑，經串聯質譜鑒別出其中8個，分別為重樓皂苷I、II、III、V、VI、VII、D和纖細薯蕷皂苷，該方法可快速鑒別重樓藥材，從整體上對藥材進行質量評價。

2 光譜指紋圖譜

2.1 紅外光譜

紅外光譜(IR)中吸收峰的位置與強度反映出化學分子結構上的差異，以此來鑒別結構，適用于固態、液態或氣態樣品的分析，具有測定快、特征性強、分辨率高、檢測無損等特點，對于中藥復雜化學成分可進行多個組分定性定量分析，成為中藥質量控制方面的一種有效手段[29-30]。

吳喆[31]采用FT-IR法分別采集滇重樓、白花重樓、毛重樓、南重樓、五指蓮共50份樣品的紅外光譜信息，發現1 653、1 156、1 082、1 021、925、851、759、572、524 cm-1等為重樓屬植物的共有峰，1 535 cm-1和1 369 cm-1是毛重樓和五指蓮的特征吸收峰，PLS-DA和PCA分析將5種重樓準確區分。同時對9種滇重樓不同炮制品整體化學成分變化進行對比研究，特征峰分布為3 387、2 923、1 745、1 463、1 338、1 240、1 207、1 158、1 180、1 080、1 048、1 020、988、921、895、859、833、765、708、572、529 cm-1，且圖譜峰形大體相似，少數特征吸收峰數目、位置和吸收強度存在差異，表明不同炮制方法造成重樓化學成分和含量的變化。余孟杰等[32]采用FT-IR對10份七葉一枝花樣品進行研究，建立IR指紋圖譜，并對3 400、2 940、1 640、1 411、1 250、1 200～950、1 150、1 020、920、860、760、700 cm-1附近的吸收峰進行了歸屬，采用相關系數法計算相似度，以此對重樓類藥材進行質量評價。鄭江萍等[33]建立了19份重樓藥材的IR指紋圖譜，共有特征峰有3 470 cm-1、2 990 cm-1、1 670 cm-1、1 420 cm-1、1 080 cm-1、960 cm-1，根據七葉一枝花、寬葉重樓、球藥隔重樓、華重樓的IR圖譜的差異，可對準確區分重樓藥材，實現快速鑒別的目的。裴藝霏[34]以云南省和貴州省采集的野生及栽培滇重樓的根莖、莖及葉作為研究材料，用FT-MIR、ATR-FTMIR、NIR等多種光譜技術采集指紋圖譜，結合多種變量篩選方法及多來源信息融合策略，建立了單一或融合PLS-DA、SVM及RF滇重樓產地鑒別及年限鑒別模型，輔以HCA及PCA方法，系統分析不同部位、年限和產地的滇重樓品質差異，建立滇重樓光譜評價體系，為滇重樓質量評價與資源合理利用提供了理論基礎。

2.2 紫外光譜

有機化合物分子結構中含有發色團、助色團等官能團，能夠產生特征性吸收光譜，可以利用紫外光譜(UV)對其進行定性鑒別。紫外指紋圖譜可獲取稀溶液中190～400 nm的化學成分的疊加信息，利用紫外光譜分析法可以檢測或測定中藥中總成分的不飽和化學鍵和共軛體系的信息[35]，特別適用于不飽和共軛體系化合物的鑒定，從而對中藥實現快速、簡便、準確地鑒別分析。

張金渝等[36]采用氯仿、無水乙醇和重蒸水3種不同極性溶劑分別對重樓樣品進行紫外吸收光譜檢測，建立了46份滇重樓及其他重樓居群的紫外光譜指紋圖譜，結果顯示，滇重樓的共有峰率在36.00%～77.78%，平均共有峰率為53.25%，滇中、滇南及滇西南、滇東南、滇西北、滇東及黔西5個相同地區內滇重樓居群平均共有峰率分別為51.69%、55.23%、52.8%、54.24%、54.63%，表明地理距離近、環境相似的居群具有較高的共有峰率，居群間化學成分相似程度高。該方法能夠將不同地理來源的滇重樓居群區分開來，也可以將滇重樓與其他重樓區分開來。

2.3 熒光光譜

熒光光譜能夠形象地反映出含有共軛雙鍵熒光組分的各種分子信息，適用于含有熒光組分的藥物成分分析，具有靈敏度高、選擇性好、測試速度快等優點，可以進行中藥藥性識別[37]，在藥物成分分析與鑒定、藥動學研究、藥理與藥效評價等方面廣泛應用。

洪淑華[27]采用熒光光譜法對9個重樓商品藥材和10個自然保護區來源重樓樣品進行分析并建立了熒光光譜指紋圖譜，在Ex280 nm/Em330 nm和Ex280 nm/Em640 nm附近均具有熒光峰，且重樓皂苷I、II的熒光峰出現在Ex220 nm/Em340 nm和Ex270 nm/Em400 nm附近，而不同產地的樣品熒光峰等高線密集程度均不一樣。商品藥材均在Ex280 nm/Em330 nm、Ex280 nm/Em640 nm、Ex230 nm/Em340 nm和Ex230 nm/Em640 nm處有熒光峰，自然保護區來源的樣品在Ex400 nm/Em680 nm等處有熒光峰，按其三維熒光圖譜可將重樓樣品分為2大類。對比熒光峰峰高發現，同一產地的樣品重樓皂苷含量不盡相同，相同部位不同來源的重樓樣品品質不一致，同株不同部位重樓樣品，根中重樓皂苷含量高于莖葉，該方法簡便可靠、簡便易行、特征性強，可作為重樓質量標準研究、品質鑒定的手段。

3 生物指紋圖譜

分子標記技術是以生物個體間遺傳物質的差異進行標記，具備靈敏度高、重現性好、分析結果準確可靠等優點。基于分子標記技術建立的生物指紋圖譜已被廣泛應用于藥用植物鑒定鑒別研究中，并成為中藥材鑒定質量控制的重要技術[38]。

辛本華等[39]對來自四川和云南的重樓屬種的遺傳多態性進行RSAP標記分析，構建出8個種的DNA指紋圖譜，借助系統進化樹可以明確不同種的進化關系，從而為重樓的種類鑒定和種間的分類地位提供分子生物學依據。劉勝坤等[40]對13份重樓進行ISSR標記分析，12條引物擴增出條帶181條，其中多態性帶174條，占比96.13%，Nei’s基因多樣性指數、香農指數及遺傳相似系數的范圍分別為0.214～0.327、0.351～0.500、0.293～0.624，并通過聚類分析將重樓種質分為3類。周武先等[41]對13份重樓樣品進行CDDP標記分析，并進行條形碼編碼，多態性條帶73個，占比91.25%，該方法檢測靈敏，可以快速鑒定重樓。Duan等[42]采用DNA條形碼結合高分辨熔融分析技術，對重樓及其偽品進行了鑒別，結果表明，內部轉錄間隔區2(ITS2)分子區域與HRM分析相結合，可以有效鑒別9種中草藥，其中包括2種重樓的正宗產地和7種常見的摻假品，DNA條形碼與HRM分析相結合是一種準確、可靠、快速、經濟、可靠的分析工具，有助于重樓的質量控制。

4 結語

重樓是我國常用的中藥材，市場需求量大，同屬植物較多，存在混淆、混用或替用現象。種質來源、生產產地及方式等諸多因素都對重樓藥材的質量產生顯著影響，并最終影響著藥物的療效及產品的穩定與可控，以單一指標成分難以控制重樓的真實品質，建立其科學可靠的質控體系十分必要。

基于光譜、色譜、生物等方法的指紋圖譜技術，可以解開重樓成分“密碼”，較為全面的反映重樓內部整體特征，對藥材實現真偽鑒別、優劣考察，區分藥材各個部位及檢測原料與成品之間的一致性和穩定性，進而對其質量進行系統描述和評價。目前，關于重樓指紋圖譜技術的研究主要集中于高效液相色譜，適用于各類藥材的快速高效質量分析。近年來，生物指紋圖譜的研究逐漸深入，借助分子遺傳標記并應用于中藥材的質量控制。但是，重樓指紋圖譜與生物活性或臨床療效等相關的化學成分的關聯性研究報道較少，有待于確定其完整的譜效關系，揭示藥材的藥效物質基礎。因此，綜合運用各種現代技術對重樓進行深度挖掘研究，進一步完善其質量控制和評價體系，可以更好地實現重樓藥材的合理開發和科學應用。