鈣敏感受體在高血壓大鼠心肌重塑和視網膜血管病變中的作用研究

趙佳琪，劉薇，唐娜，王臘梅，屈媛媛，席冬梅，鐘華，何芳*

高血壓是一種常見的心血管疾病，高血壓的持續進展可引起心、腦、全身血管系統多個靶器官損害［1］，因此血壓的監測對高血壓的防控具有重要意義。視網膜血管作為全身唯一可以直接通過肉眼觀察的血管，關注其變化對高血壓的進展評估具有一定的價值［2］。

鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）是G蛋白偶聯受體C家族的成員之一，存在于甲狀旁腺、腎臟、腸道、骨骼等組織中［3］，在感知細胞外Ca2+和維持細胞內外Ca2+穩態的信號通路中起關鍵作用［4］。本課題組前期研究發現，CaSR激動劑可有效降低血壓，改善心肌重塑［5］。2018年CaSR首次在大鼠視網膜中被發現，并證明CaSR的表達降低與糖尿病視網膜病變發生有關［6］，但CaSR在高血壓視網膜血管中的影響鮮見報道。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是誘導血管生成的重要細胞因子，與高血壓有著密切聯系［7］。哺乳動物的VEGF家族由五種糖蛋白組成：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盤生長因子［8］，其中VEGFA是血管生成的關鍵媒介，通過與血管內皮細胞上表達的VEGF受體1（VEGFR-1）和VEGF受體2（VEGFR-2）結合，影響血管通透性和血管新生［9］。在多項研究中發現，CaSR可與VEGF共同參與心血管疾病的發展［10-11］。故本研究通過探究CaSR在高血壓大鼠心臟與視網膜血管中的作用，分析CaSR與VEGF在高血壓視網膜血管病變中的關系，以期對高血壓及高血壓靶器官損害的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究時間為2021年5—12月。從北京維通利華實驗動物有限責任公司購買（許可證編號：SCXK京2021-0006）7周齡清潔級健康雄性自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）及同源相同周齡正常血壓大鼠（wistar-kyoto rats，WKY），體質量約180 g，飼養于石河子大學醫學院動物房，普通飲食飼養，保證飼養環境安靜整潔，避免嘈雜。實驗經石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（批準號：A2020-164-01）。

1.2 主要試劑和儀器 NPS2143（美國R&D公司），CaSR單克隆抗體（武漢三鷹公司），VEGFA單克隆抗體（武漢博士德公司），蘇木素-伊紅（HE）染液（江蘇碧云天公司），DAB顯色劑（北京中山金橋公司），聚合酶鏈式反應（PCR）引物（上海生工生物工程有限公司），逆轉錄試劑盒（北京全式金公司），PCR綠色熒光染料（上海賽默飛世爾科技公司），DNA marker II（上海賽默飛世爾科技公司），RNA提取液（美國Invitrogen公司），PCR核酸擴增儀（日本Takara 公司），低溫超速離心機（美國Thermo 公司），奧林巴斯TH4-200倒置顯微鏡（日本SANYO公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組 7周齡雄性WKY大鼠10只及同源相同周齡SHR大鼠20只，適應性飼養1周以適應環境，將SHR大鼠隨機分為SHR組（n=10）和抑制劑（SHR+NPS2143）組（n=10）；WKY大鼠歸為WKY組（n=10）。SHR+NPS2143組 以 4.5 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射CaSR抑制劑NPS2143，WKY組和SHR組注射等量0.9%氯化鈉溶液，共注射16周至大鼠周齡24周。將所有大鼠分組飼養。

1.3.2 血壓測量 分別在持續干預0周（8周齡）和干預16周（24周齡）時每組選取5只大鼠，用Softron BP-98A（SOFTRON，日本）大鼠尾部無創血壓計測量各組大鼠尾部動脈的收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），用公式計算平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP），MAP=1/3 SBP+2/3 DBP。室溫下，將大鼠固定在大鼠箱中，尾根放置并固定在血壓計的充氣尾套中，每只大鼠重復測量3次，并取平均值。

1.3.3 取材 眼球：干預0周（8周齡）時每組選取5只大鼠，干預16周（24周齡）時每組選取剩余5只大鼠，稱重并根據體質量給予麻醉劑，麻醉后處死大鼠，快速摘出左眼并于1×PBS緩沖液中稍加清洗，浸沒于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存用于制作病理切片。摘出右眼于1×PBS緩沖液清洗后，置于裝有4%多聚甲醛溶液的培養皿中固定90 min后，1×PBS緩沖液反復清洗后，移至立式顯微鏡下。眼科有齒鑷夾住視神經斷端，固定眼球，用角膜剪沿角鞏膜緣剪下角膜。用鑷子將晶狀體挑出后，用1×PBS緩沖液沖洗剩余眼球內壁，去除殘留玻璃體后，用鑷子將視網膜完整剝離下來后轉移至EP管，標記后-80 ℃冰箱保存。

心臟：分別在持續干預0周（8周齡）和干預16周（24周齡）時將已取眼球的5只大鼠用組織剪剪開胸骨，露出心臟。迅速取出心臟，分離出左心室，稱重并記錄，計算心臟/體質量（HW/BW%）和左心室/體質量（LVW/BW%）。將心肌組織洗凈后包裹在錫箔紙中，儲存在-80 ℃冰箱中，以便日后檢測目標蛋白。

1.3.4 馬松（Masson）染色 心肌組織于4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h。梯度酒精脫水后石蠟包埋切片，切片厚5μm。采用Masson染色，顯微鏡下觀察。隨機選取每個組織的3個顯微鏡視野并攝片（×400），使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計算心肌細胞膠原沉積面積，并計算心肌組織膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF），CVF=心肌細胞膠原沉積面積/心肌細胞總面積×100%。

1.3.5 HE染色 摘除的各組大鼠眼球于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋切片，切片厚5μm。用HE染色，顯微鏡下觀察視網膜結構變化，隨機選取每個組織的3個顯微鏡視野并攝片（×400），用Image J軟件測量視網膜各層厚度。

1.3.6 免疫組織化學染色 將WKY組和SHR組干預0周的視網膜切片去石蠟后，高壓抗原修復10 min，內源性過氧化物酶抑制劑覆蓋切片，室溫孵育10 min，而后將視網膜切片與抗CaSR的一級大鼠單克隆抗體（1∶50）、抗VEGFA的一級大鼠單克隆抗體（1∶50）在4 ℃下孵育過夜。次日PBS緩沖液沖洗3遍后，將切片與辣根過氧化物酶結合的二抗在37 ℃下孵育30 min。沖洗后滴加DAB溶液顯色，紫木蘇復染，脫水封片。顯微鏡下觀察CaSR、VEGFA免疫陽性產物并攝片（×400）。

1.3.7 實時熒光定量PCT（qRT-PCR） 從干預16周3組的視網膜組織中提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計測量總RNA的濃度和純度。并根據制造商的操作手冊將3 mg總RNA逆轉錄為cDNA。20 μl的熒光定量PCR體系包括：2×Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、上、下游引物各 1 μl、模板cDNA 1 μl、RNase-free water 7 μl。PCR 條 件：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共38個循環；65～95 ℃制作融解曲線。基因的相對表達量與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（內部參考基因）進行了歸一化。采用ABI7500實時PCR系統進行操作。CaSR、VEGFA和GAPDH的引物來自上海生工生物工程有限公司，引物序列如表1所示。使用Image J軟件對各組CaSR、VEGFA、GAPDH灰度值進行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences for GAPDH，VEGFA and CaSR

1.4 統計學分析 采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠干預0周、16周血壓比較 3組大鼠干預0周、16周SBP、DBP、MAP比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中SHR組干預0周、16周SBP、DBP、MAP高于WKY組，SHR組干預16周SBP、DBP、MAP低于SHR+NPS2143組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。SHR組、SHR+NPS2143組干預16周SBP、DBP、MAP高于干預0周，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組大鼠干預0周、16周血壓比較（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of blood pressure in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表2 3組大鼠干預0周、16周血壓比較（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of blood pressure in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

注：SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，MAP=平均動脈壓，WKY組=正常血壓大鼠組，SHR組=自發性高血壓大鼠組，SHR+NPS2143組=NPS2143抵制劑干預自發性高血壓大鼠組；1 mm Hg=0.133 kPa；a表示與同周齡WKY組比較P＜0.05；b表示與同周齡SHR+NPS2143組比較P＜0.05

組別 只數 SBP DBP MAP干預0周 干預16周 t配對值 P值 干預0周 干預16周 t配對值 P值 干預0周 干預16周 t配對值 P值WKY 組 5 107±1 108±1 0.260 0.999 92±6 101±10 1.744 0.575 95±3 103±6 1.973 0.479 SHR組 5 116±1a 170±6ab 22.610 ＜0.001 108±5a 141±10ab 5.610 0.002 111±3a 150±9ab 8.959 ＜0.001 SHR+NPS2143組 5 116±4 184±1 25.280 ＜0.001 109±2 169±6 9.332 ＜0.001 112±1 174±4 12.950 ＜0.001 F值 124.500 259.300 12.910 30.420 30.220 57.880 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.007 0.010 0.004 0.004

2.2 3組大鼠心肌重塑情況比較 3組大鼠干預16周HW/BW%、LVW/BW%、CVF比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中SHR組干預16周HW/BW%、LVW/BW%、CVF高于WKY組，低于SHR+NPS2143組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。SHR組、SHR+NPS2143組干預16周HW/BW%、LVW/BW%、CVF高于干預0周，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3，圖1。

表3 3組大鼠干預0周、16周心肌重塑情況比較（±s，%）Table 3 Comparison of HW/BW%，LVW/BW%，and myocardial collagen volume fraction in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表3 3組大鼠干預0周、16周心肌重塑情況比較（±s，%）Table 3 Comparison of HW/BW%，LVW/BW%，and myocardial collagen volume fraction in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

注：a表示與同周齡WKY組比較P＜0.05，b表示與同周齡SHR+NPS2143組比較P＜0.05；HW/BW%=心臟/體質量，LVW/BW%=左心室/體質量，CVF=心肌組織膠原容積分數

組別 只數 HW/BW% LVW/BW% CVF干預0周 干預16周 t配對值 P值 干預0周 干預16周 t配對值 P值 干預0周 干預16周 t配對值 P值WKY 組 5 0.320±0.006 0.340±0.006 2.909 0.094 0.230±0.010 0.240±0.003 1.401 0.644 3.06±0.52 3.06±0.04 0.001 0.999 SHR組 5 0.330±0.002 0.370±0.001ab 6.898 0.001 0.220±0.011 0.280±0.008ab 6.672 ＜0.001 2.93±0.64 7.41±0.54ab 3.834 0.032 SHR+NPS2143組 5 0.330±0.003 0.390±0.008 3.803 0.026 0.240±0.011 0.310±0.005 4.880 0.002 2.74±0.37 9.90±0.03 4.577 0.013 F值 3.610 2.235 1.065 58.590 0.097 122.600 P值 0.159 0.002 0.447 ＜0.001 0.910 0.001

圖1 3組大鼠干預0周、16周心肌組織（Masson染色，×400）Figure 1 Myocardial tissue in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

2.3 3組大鼠視網膜結構變化 SHR組干預0周、16周視網膜各層排列不規則，其中內界膜不規則較為明顯，神經纖維層疏松，SHR+NPS2143組干預16周以上改變更加明顯，見圖2。3組大鼠干預0周、16周視網膜總厚度、內叢狀層厚度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中SHR組干預0周、16周視網膜總厚度、內叢狀層厚度高于WKY組，SHR組干預16周視網膜總厚度、內叢狀層厚度低于SHR+NPS2143組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。3組大鼠干預16周視網膜內核層厚度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中SHR組干預16周視網膜內核層厚度高于WKY組，低于SHR+NPS2143組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。3組大鼠干預16周視網膜總厚度、內叢狀層厚度、內核層厚度高于干預0周，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

圖2 3組大鼠干預0周、16周視網膜結構（HE染色，×400）Figure 2 Retinal structure in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表4 3組大鼠干預0周、16周視網膜各層厚度比較（±s，μm）Table 4 Comparison of total retinal thickness in three group of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表4 3組大鼠干預0周、16周視網膜各層厚度比較（±s，μm）Table 4 Comparison of total retinal thickness in three group of rats at baseline and 16 weeks of intervention

注：a表示與同周齡WKY組比較P＜0.05，b表示與同周齡SHR+NPS2143組比較P＜0.05

組別 只數 視網膜總厚度 視網膜內叢狀層厚度 視網膜內核層厚度干預0周 干預16周 t配對值 P值 干預0周 干預16周 t配對值 P值 干預0周 干預16周 t配對值 P值WKY組 5 56.08±4.69 95.01±1.36 14.430 ＜0.001 12.59±1.99 22.23±1.69 4.544 0.002 5.81±0.63 12.09±1.21 6.650 ＜0.001 SHR組 5 72.18±9.02a 112.89±8.69ab 12.290 ＜0.001 19.76±0.51a33.94±3.16ab 6.744 ＜0.001 7.45±0.57 15.59±1.05ab 11.180 ＜0.001 SHR+NPS2143組 5 70.63±2.63 193.24±29.15 36.670 ＜0.001 19.33±0.58 55.33±9.95 17.120 ＜0.001 7.87±0.96 25.27±2.46 22.810 ＜0.001 F值 9.796 222.700 138.700 45.340 1.062 84.190 P值 0.029 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.413 0.001

2.4 CaSR、VEGFA定位與表達 免疫組化結果可見，干預0周，WKY組CaSR免疫陽性產物主要分布于內界膜及神經節細胞層，胞質呈深棕黃色，陽性產物表達較強，SHR組CaSR免疫陽性產物主要分布于少數神經節細胞的胞漿中，陽性產物表達較弱；WKY組VEGFA免疫陽性產物主要分布于少數神經節細胞的胞漿中，陽性產物表達較弱，SHR組VEGFA免疫陽性產物主要分布于神經節細胞層、內核層及外叢狀層，胞質呈深棕黃色，陽性產物表達較強（圖3）。qRT-PCR檢測結果可見，干預16周，3組大鼠視網膜中CaSR、VEGFA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中SHR組視網膜中CaSR表達低于WKY組、高于SHR+NPS2143組，SHR組視網膜中VEGFA水平高于WKY組、低于SHR+NPS2143組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 3組大鼠干預16周視網膜中CaSR、VEGFA表達比較（±s）Table 5 Expression of CaSR and VEGFA in retinal tissues in three groups of rats at 16 weeks of intervention

表5 3組大鼠干預16周視網膜中CaSR、VEGFA表達比較（±s）Table 5 Expression of CaSR and VEGFA in retinal tissues in three groups of rats at 16 weeks of intervention

注：a表示SHR組與同周齡WKY組比較P＜0.05；b表示與SHR+NPS2143組比較P＜0.05

組別 CaSR VEGFA WKY組 1±0 1±0 SHR 組 0.35±0.03ab 3.82±0.53ab SHR+NPS2143組 0.13±0.02 11.48±0.56 t值 1223 383 P 值 ＜0.001 ＜0.001

圖3 WKY組和SHR組干預0周視網膜組織中CaSR、VEGFA定位Figure 3 Localization of CaSR and VEGFA in retinal tissues in rats of WKY group and SHR group at baseline

3 討論

長期高血壓控制不良可造成心臟結構、功能發生變化，包括左心室舒張功能障礙、左心室肥厚、心肌收縮功能障礙，最終引發心力衰竭。相較于血壓正常的患者，光學相干斷層掃描（OCT）檢查觀察到高血壓患者的視網膜多層結構反射不平整，厚度增厚［12］。臨床上對于高血壓引起的靶器官損害治療主要為全身降壓、營養神經、輔以局部注藥，但療效并不顯著。

CaSR通過調節多種信號途徑發揮生物學效應，參與高血壓的發生、發展［13-15］。激活CaSR，可以抑制腎素的分泌，進而降低血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）和醛固酮的水平，使血壓降低［16］。而CaSR介導的多種功能主要與親水的細胞外結構（ECD）有關，其除了能與多價陽離子（如Ca2+，Mg2+，Gd3+等）［17］、多胺類（如精胺等）及某些抗生素（如新霉素等）直接結合外，也受到別構激動劑（西那卡塞、calindol）和別構抑制劑（NPS2143和Calhex-231）的影響［18］。為了探究CaSR在高血壓心肌重塑及視網膜血管病變的作用，本研究結果發現SHR組大鼠血壓高于WKY組，視網膜結構紊亂，視網膜總厚度高于WKY組，視網膜中CaSR表達水平低于WKY組，SHR+NPS2143組血壓高于SHR組，視網膜結構紊亂明顯，視網膜中CaSR表達水平低于SHR組，提示高血壓引起的視網膜血管病變可能與CaSR表達降低有關。而在未干預時，SHR組大鼠與WKY組大鼠的HW/BW%、LVW/BW%比較未見明顯差異，也無明顯心肌膠原沉積，干預16周 后，SHR組 大 鼠HW/BW%、LVW/BW%、CVF高于WKY組，SHR+NPS2143組大鼠心肌細胞CVF高于SHR組，這表明高血壓心肌重塑主要發生在高血壓后期，應用CaSR抑制劑加重了這一過程的發生、發展。由于心肌肥厚早期的可逆轉性，高血壓患者發現左心室肥厚之后，積極有效的降壓治療可以最大限度地延緩病情進展，降低并發癥的發生率［2］。本研究結果發現，干預0周SHR大鼠視網膜厚度高于WKY組，而心肌HW/BW%、LVW/BW%、CVF比較未見明顯差異，這表明高血壓視網膜結構改變早于心肌病變，提示可以通過視網膜血管檢查評估高血壓心肌重塑狀態，且視網膜檢查相較心臟檢查更為簡單易行，便于基層及社區醫院開展，也極大提高了患者尤其是高齡患者的依從性，有助于高血壓的篩查及早期防控，延緩高血壓引起的心功能不全，降低意外風險與病死率。

早期研究發現，當患者發生高血壓時，血清中VEGF表達水平升高［19］。研究指出VEGF可通過提高電壓依賴性鈣通道的激活電壓，減少細胞外Ca2+進入細胞內［20］，可刺激血管生成［21］。臨床上局部注射抗VEGF藥物（如雷珠單抗，阿柏西普），可減少高血壓性視網膜新生血管的生成。但大多數人對此治療會產生抵抗力，治療效果不佳，同時抗VEGF藥物也可引起血管收縮與舒張功能失衡，導致全身血壓升高［22］。本研究發現，干預16周SHR組大鼠視網膜中VEGFA表達增加。臨床上將抗VEGF單克隆抗體作為血管生成抑制劑，通過阻斷VEGF改善視網膜缺血和缺氧，抗VEGF治療已被推薦為視網膜靜脈阻塞（RVO）的一線治療方法［23-24］。然而大多數人最終會對目前的血管生成抑制劑療法產生抵抗，減弱治療效果，因此提出通過應用G蛋白偶聯受體可以降低VEGF抑制劑的耐受性［25］。在使用了CaSR抑制劑NPS2143處理后，SHR+NPS2143組大鼠視網膜中CaSR進一步減少，VEGFA表達明顯增加。提示CaSR抑制劑通過減少CaSR活化增強VEGF在視網膜中的作用，臨床中可通過擬鈣劑與VEGF抑制劑的聯合應用，在降低血壓的同時，降低機體對VEGF抑制劑的耐受性，增強藥物在高血壓中的治療效果。

綜上所述，應用CaSR抑制劑，可減少CaSR活化，促進視網膜中VEGFA表達增加，加劇高血壓引起的心肌重塑與視網膜血管病變的發展，且視網膜血管病變發生早于心臟，這也為臨床高血壓及其引起的靶器官損害的早期防控提供了新思路。但本研究也存在一定的不足，CaSR激活后可能會降低VEGFA表達，但其對眼壓的作用因實驗儀器的局限未能加以證明，有待后續研究。因實驗儀器的局限未能對眼底進行檢查或拍照，也有待后續研究驗證。

作者貢獻：趙佳琪提出研究選題方向，進行文章的構思與設計，負責數據收集和統計學分析；趙佳琪、劉薇、唐娜、王臘梅負責撰寫論文和論文修訂；劉薇、唐娜、屈媛媛、席冬梅負責數據收集、統計學分析、繪制圖表；鐘華、何芳進行數據復核，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責；所有作者確認了論文的最終稿。

本文無利益沖突。