川芎嗪對人非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的相關(guān)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平的影響

王小梅，薛春苗，王艷梅，梁 玲，張寒蕾，梁 艷

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

對于進(jìn)展期肺癌，盡管分子靶向治療和免疫療法逐漸興起，并已獲得良好療效，但均會發(fā)生耐藥，最終還是要考慮化療［1］。因此，化療在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療中所占比例仍然較大。鉑類（含順鉑）是NSCLC化療的主要藥物，一線化療方案中多與之聯(lián)合應(yīng)用［2］。而化療藥物獲得性耐藥的發(fā)生，是導(dǎo)致NSCLC治療失敗、疾病進(jìn)展和預(yù)后不良的主要原因［3］。其主要機(jī)制是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC）家族中與耐藥相關(guān)的ABC（ABCB1、ABCC1和ABCG2）表達(dá)過量［4］。雖然針對ABCB1、ABCC1和ABCG2抑制劑的研究一直在繼續(xù)，也產(chǎn)生了一些抑制劑（如Tariquidar等），但在臨床實(shí)驗(yàn)中均遭遇了失敗，使得耐藥問題沒有得到緩解［5］。中藥涵蓋物質(zhì)廣泛，針對腫瘤耐藥，中藥也有許多單體和復(fù)方可發(fā)揮逆轉(zhuǎn)效果［6］。其中川芎嗪聯(lián)合環(huán)孢素A不僅對多藥耐藥的K562/DMR細(xì)胞有明顯增敏作用，還能直接逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性［7-9］。但是，川芎嗪逆轉(zhuǎn)A549耐順鉑細(xì)胞藥株（A549/DDP）對順鉑耐藥的機(jī)制尚不明確，本研究以人NSCLC耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP為模型，通過研究川芎嗪對ABCB1、ABCC1和ABCG2表達(dá)水平的影響，研究其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制，為開發(fā)化療耐藥逆轉(zhuǎn)藥物提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾公司，HERACell 150i），液氮儲存系統(tǒng)（美國賽默飛世爾公司，LOCATOR 6 PLUS），潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，HDLDL-CJ-2ND I），倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，IX7），低溫高速離心機(jī)（美國西格瑪公司，3K15），酶標(biāo)儀（美國普洛麥格公司，E9032），電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司，Universal HoodⅡ），分析天平（德國賽多利斯公司，R200D），超純水一體化系統(tǒng)（德國Milli-Q Integral公司），電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，DZKW-4），恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9140H），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國賽默飛世爾公司，2720型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1640培養(yǎng)基（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號19217008），胎牛血清（美國依科賽生物公司，批號430790），0.25%胰酶消化液（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號25200056），青霉素-鏈霉素混合液（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號15140122），磷酸鹽緩沖液配液鹽（北京索萊寶公司，批號CB3409949，按說明配制后高溫高壓消毒備用），細(xì)胞計(jì)數(shù)套裝8檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，批號CK04-500），全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物有限公司，批號KGP902），BCA蛋白定量試劑盒（南京凱基，批號KGP902），6孔板、25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、15 mL離心管、細(xì)胞刮刀等（美國Corning公司），離心管、移液槍頭（美國Axygen公司），移液槍（1000、500、200、100、20、10μL等規(guī)格）（德國eppendorf公司），0.45μm膜（德國Meck Mllipoore公司），顯影液［美國伯樂（BIO-RAD）公司］，日本TOYOBO抗體稀釋液，北京普利萊公司分離膠和濃縮膠緩沖液、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、封閉液、燈神緩沖鹽溶液（TBS）、洗膜緩沖液（TBST），總RNA抽提劑（Trizol）、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）、核糖核酸酶（RNase）抑制劑、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物。

1.3 藥物與細(xì)胞

順鉑（美國Bioruler公司，批號RH66694-100 mg，純度＞99.9%），ABC抑制劑Tariquidar（美國Selleck公司，批號S8082，20mg），川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品（美國Bioruler公司，RB14186-20 mg，純度＞99.8%）；ABCB1單克隆抗體（批號13342）、ABCC1單克隆抗體（批號72202）、ABCG2單克隆抗體（批號42078）均購自美國Cell Signal Technology公司；β-actin單克隆抗體（批號60008-1-Ig），羊抗兔二抗（批號SA00001-2），羊抗鼠二抗（批號SA00001-1）均購自美國Proteintech公司。

人肺腺癌細(xì)胞株A549，購于上海ATCC細(xì)胞庫；A549/DDP購于北京北納聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)研究院。以上細(xì)胞儲存條件均為液氮存儲。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥性測定

A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞復(fù)蘇后均用1640完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗）培養(yǎng)，生長至85%融合度時，傳代培養(yǎng)。A549/DDP細(xì)胞傳代后，用含有6.67μM DDP的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，以維持其對順鉑的耐受性。實(shí)驗(yàn)均取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行，A549/DDP細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前用不含DDP的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。

取對數(shù)期A549細(xì)胞，按照5000個/孔的濃度接種于96孔板，恒溫培養(yǎng)箱貼壁生長12 h后加入梯度濃度順鉑（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μM），每個梯度設(shè)5個復(fù)孔，恒溫箱孵育24 h后每孔加入CCK-8溶液10μL，恒溫箱孵育60 min后讀取450 nm處光密度（OD）值。根據(jù)試劑盒說明計(jì)算細(xì)胞活性，用GrapfPad Prism 8.0回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。用較大梯度濃度順鉑（125、250、500、1000、2000μM）測定A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50，方法同A549細(xì)胞。A549/DDP的耐藥指數(shù)=IC50（A549/DDP）/IC50（A549）。

2.2 川芎嗪對A549/DDP細(xì)胞的毒性分析

隨著川芎嗪濃度的增加，其對細(xì)胞的毒性也呈現(xiàn)遞增，通過A549/DDP細(xì)胞量效毒性分析，遴選出用于發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥效果的工作濃度。取對數(shù)期A549/DPP細(xì)胞，按照10 000個/孔接種于96孔板，貼壁生長12 h后，加入含梯度濃度（50、100、150、200、250μM）川芎嗪的1640培養(yǎng)基，每個濃度梯度設(shè)置5個復(fù)孔。37℃恒溫孵育24 h后加入CCK-8溶液，孵育60 min后讀取450 nm處OD值。根據(jù)試劑盒說明計(jì)算細(xì)胞活性。

2.3 川芎嗪逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性

取對數(shù)生長期A549/DDP細(xì)胞，5000個/孔接種于96孔板，貼壁生長12 h后更換含有工作濃度川芎嗪的培養(yǎng)基，孵育24 h后加入梯度濃度（125、250、500、1000、2000μM）順鉑，孵育24 h后同前法計(jì)算IC50，逆轉(zhuǎn)指數(shù)=IC50（A549/DDP）/IC50（A549/DDP-TMP）。

2.4 免疫印跡法（Western Blot）和RT-PCR實(shí)驗(yàn)分組及處理

在Western Blot實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置空白組、模型組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組。空白組取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板，模型組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組均取對數(shù)生長期A549/DDP細(xì)胞接種于6孔板，以上各組均設(shè)置3個復(fù)孔。貼壁生長12 h后分別給藥：空白組和模型組更換1640完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組更換含有100μM川芎嗪的1640完全培養(yǎng)基，陽性對照組更換含有1μM Tariquidar的1640完全培養(yǎng)基，孵育24 h后進(jìn)行下一步研究。

2.5 Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)各組按2.4步驟處理后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）將細(xì)胞洗3遍，6孔板每孔加入150μL含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，反應(yīng)30 min后用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，移入1.5 mL離心管中，4℃，12 000 r/min離心30 min，吸取上清液移入新的離心管中。依據(jù)BCA蛋白定量試劑盒操作說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定待測樣品蛋白濃度，并調(diào)整至統(tǒng)一的蛋白濃度。蛋白濃度調(diào)整后加入同體積2×加樣緩沖液，沸水水浴5 min變性后放冰上冷卻，-80℃保存待用。以上操作均在冰上完成。

根據(jù)所測蛋白分子量配制相應(yīng)濃度分離膠，加樣后分別進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)移，封閉液封閉60 min后與一抗（稀釋比為ABCB1 1∶1000、ABCG2 1∶1000、ABCC1 1∶1000，β-actin 1∶1000）孵育過夜，TBST沖洗3遍，然后與二抗（稀釋比為羊抗兔二抗1∶20 000、羊抗鼠二抗1∶20 000）孵育30 min，孵育結(jié)束后TBST再沖洗3次，沖洗結(jié)束后加預(yù)配的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影2 min、拍照。ImageJ軟件分析相對蛋白含量，用各條帶灰度值/內(nèi)條帶的灰度值表示。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)2次。

2.6 RT-PCR檢測耐藥相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)

實(shí)驗(yàn)各組按2.4步驟處理后，棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的Trizol，每孔1 mL，冰上孵育30 min后使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，移入1.5 mL離心管中。每管加入45μL無RNase的水，溶解RNA。取0.2 mL薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入含染料2×聚合酶混合物（Ex TaqMix）12.5μL、10μM引物混合物0.75μL（見表1）、對應(yīng)的cDNA各1μL，其中一管不加模板用作陰性對照，各管補(bǔ)加水至25μL。混勻后置于PCR儀中，95℃5min預(yù)變性，95℃10s→60℃30s→72℃30 s，40次循環(huán)，4℃暫停。120 V電壓下電泳20 min，電泳結(jié)束后在凝膠紫外分析儀照相。結(jié)果采用2△△CT值相對定量法表示，△CT值=各樣本目的基因CT值-相對應(yīng)的內(nèi)參基因CT值，△△CT值=（各樣本△CT值-對照△CT值）/2。2△△CT值表示各樣本目的基因表達(dá)情況。

表1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)引物信息

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性

順鉑作用于A549細(xì)胞株，IC50為（28.33±3.19）μM；作用于A549/DDP細(xì)胞株，IC50為（983.43±101.67）μM。A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥指數(shù)為34.71（圖1）。A549/DDP細(xì)胞株是由A549細(xì)胞株經(jīng)梯度濃度順鉑長期培養(yǎng)獲得。

圖1 人非小細(xì)胞肺癌A549/DDP對順鉑的耐藥性

3.2 川芎嗪對A549/DDP細(xì)胞的毒性

本研究所遴選的逆轉(zhuǎn)耐藥川芎嗪濃度，對A549/DDP細(xì)胞活性無明顯抑制作用。當(dāng)川芎嗪濃度低于150μM時，A549/DDP細(xì)胞活性無明顯受抑（圖2A），后續(xù)逆轉(zhuǎn)耐藥實(shí)驗(yàn)中，均遴選100μM作為川芎嗪逆轉(zhuǎn)耐藥的工作濃度。同時選取Tariquidar作為p-糖蛋白抑制劑陽性對照。工作濃度川芎嗪孵育過的A549/DDP細(xì)胞，其順鉑IC50為（128.10±12.29）μM（圖2B），其逆轉(zhuǎn)指數(shù)為7.68。1μM濃度Tariquidar孵育過的A549/DDP細(xì)胞，其順鉑IC50為（171.19±15.66）μM（圖2C），其逆轉(zhuǎn)指數(shù)為5.74。

圖2 川芎嗪逆轉(zhuǎn)人肺腺癌A549/DDP耐藥效果

3.3 川芎嗪對A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見ABCB1、ABCC1和ABCG2條帶在空白組、模型組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組的印跡（圖3A）。模型組ABCB1、ABCC1和ABCG2的表達(dá)水平均顯著高于空白組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組ABCB1、ABCC1和ABCG2的表達(dá)水平均顯著低于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖3B-D。

3.4 川芎嗪對A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組ABCB1、ABCC1和ABCG2 mRNA的表達(dá)水平均顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組ABCB1和ABCC1 mRNA的表達(dá)水平均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組ABCG2 mRNA的表達(dá)水平與模型組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3E-G。

圖3 川芎嗪對人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥蛋白表達(dá)的影響

4 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤［10］，NSCLC約占全部肺癌的83%。臨床治療中，早期（Ⅰ期和Ⅱ期）患者化療所占比例約為25%，進(jìn)展期（Ⅲ期和Ⅳ期）患者化療所占比例約為53%［11］。進(jìn)展期肺癌以內(nèi)科治療為主，包括針對敏感基因突變的靶向治療、免疫檢測點(diǎn)抑制劑單藥或聯(lián)合治療、化療等［2］。當(dāng)疾病進(jìn)展或患者確定為非敏感人群時，化療仍發(fā)揮重要作用，而化療獲得性耐藥的發(fā)生，將導(dǎo)致治療失敗。獲得性耐藥產(chǎn)生的機(jī)制主要包括：ABCB1、ABCC1和ABCG2表達(dá)增加，細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出增多導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降；藥物吸收特性改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物減少；藥物的代謝速度增快；藥物的靶點(diǎn)改變；細(xì)胞周期檢測點(diǎn)和凋亡通路改變阻礙細(xì)胞死亡等［11-12］。與獲得性耐藥相關(guān)的蛋白，除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體外，還有肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）等［13］，這些蛋白在藥物代謝的不同階段導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。在上述機(jī)制中，耐藥相關(guān)的ABC表達(dá)增加被認(rèn)為是最重要的機(jī)制，是臨床療效減弱和治療失敗的主要原因［14-15］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中參與腫瘤耐藥的亞型主要包括ABCB1、ABCG2和ABCC蛋白亞家族［16-22］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體利用ATP水解的能量將底物（抗癌藥物）轉(zhuǎn)運(yùn)出腫瘤細(xì)胞，使藥物作用下降，導(dǎo)致獲得性耐藥的發(fā)生［23］。因此，需要進(jìn)一步擴(kuò)寬視野，兼顧人工合成與天然藥物篩選，并在天然藥物基礎(chǔ)上進(jìn)行加工修飾［24］。

川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，臨床多用于閉塞性腦血管疾病等［25］。川芎嗪是從川芎中分離出的主要有效成分。在體外實(shí)驗(yàn)中能抑制惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，直接抑制人NSCLC耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP并誘導(dǎo)其凋亡［26］，同時還能逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性［26－30］。

本研究通過對比人NSCLC細(xì)胞株A549及其順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP對順鉑的耐受性，確定A549/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)，并應(yīng)用細(xì)胞增殖活性研究，遴選既能發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥又不影響細(xì)胞活性的川芎嗪工作濃度。該工作濃度的川芎嗪對A549/DDP的順鉑耐藥性有明顯逆轉(zhuǎn)作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明，川芎嗪能下調(diào)A549/DDP細(xì)胞ABCB1、ABCC1和ABCG2的表達(dá)水平以及ABCB1、ABCC1 mRNA的表達(dá)水平，但對ABCG2 mRNA的表達(dá)水平無下調(diào)作用，其調(diào)節(jié)ABCG2的表達(dá)可能是在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步揭示了川芎嗪逆轉(zhuǎn)腫瘤化療的機(jī)制，為開發(fā)新藥提供了線索。