丹參總黃酮提取工藝的優化及其抑菌活性研究

龍 旭，王蕾萌，龔 莉，雷亞婷，郭 惠，靳如意

(陜西中醫藥大學 陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心，陜西 咸陽 712046)

丹參為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(SalviamiltiorrhizaBunge.)植物的根莖，因根莖顏色多為紅色且形似參類而得名[1-2]。丹參味苦，性微寒，歸心經、肝經，具有祛瘀止痛、舒筋活血、清心避暑、抗菌消炎、涼血消癰等功效[1-6]，可用于治療月經不調、經閉痛經、熱痹疼痛、冠心病、高血壓、心絞痛、心肌缺血、肝硬化、腫瘤等癥[4-8]。丹參中的丹參素、丹酚酸、丹酚酸甲酯、迷迭香酸、咖啡酸等為水溶性成分，具有改善微循環、抗血栓等作用[5]。丹參中以松香烷型二萜類化合物為主的成分，如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅵ、異丹參酮、隱丹參酮等為脂溶性成分，具有抗癌、保護心臟和神經的作用[5-8]。基于丹參黃酮類物質廣泛的藥理活性，其相關藥物研發成為研究熱點。

黃酮類物質傳統的提取工藝主要包括浸漬法、滲漉法、水煮法、有機溶劑回流提取法等，但普遍存在雜質含量高、提取率低、提取時間長、溶劑消耗量大等缺點。超聲提取法利用超聲波輻射產生強烈的空化效應、機械振動、擾動效應和攪拌等多種作用，加快物質分子振動的頻率和速度，提高溶劑的穿透力，從而擊破植物細胞壁，高效、快速地提取細胞內容物[9]。與傳統的水煮法及有機溶劑回流提取法相比，超聲提取法具有速度快、提取率高、適用范圍廣、不破壞中藥材活性成分的化學結構等特點。丹參總黃酮可破壞細菌DNA致其死亡，尤其對革蘭氏菌的抑制效果顯著，可開發為天然防腐劑[10]。在此，作者通過單因素實驗對超聲提取法和熱回流提取法提取丹參總黃酮進行比較研究，再通過響應面法進一步優化丹參總黃酮的提取工藝，并研究丹參總黃酮對革蘭氏菌的抑制活性，為陜西省道地藥材丹參的高效提取及深入開發奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

丹參(根莖)，西安藥材市場。

硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純；蘆丁標準品(HPLC 純度98%)；二次水，自制。

TP-A200型電子天平，福州華志科學儀器有限公司；FSJ-A03D1型粉碎機，廣東小熊電器有限公司；HJ-3A型磁力攪拌器，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；SHB-Ⅲ型真空泵，西安大康生物科技有限公司；DHG-9030型干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；UV1102型紫外可見分光光度計，上海天美科技儀器有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-200A型旋轉蒸發儀，西安予輝儀器有限公司。

1.2 蘆丁標準曲線的繪制

參照文獻[11]配制系列濃度的蘆丁標準溶液，于最大吸收波長510 nm處分別測定其吸光度，以濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，擬合得到線性回歸方程為：A=0.0011+9.42286c，R2=0.99996。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3 丹參總黃酮的提取

將丹參于50 ℃干燥5 h，自然冷卻后，粉碎，過80目篩，得到丹參細粉，于密封袋保存，備用。精確稱取5.0 g丹參細粉于回流瓶中，按料液比1∶10(g∶mL，下同)加入50 mL一定體積分數的乙醇，65 ℃超聲提取50 min或回流提取120 min，抽濾；殘渣重復提取2次，合并濾液，旋轉蒸發，萃取，定容后，測定510 nm處吸光度。按下式計算丹參總黃酮提取率(mg·g-1)：

式中：c為經標準曲線方程計算得到的提取液中總黃酮濃度，mg·mL-1；V為提取液體積，mL；m為丹參細粉質量，g。

1.4 丹參總黃酮的抑菌活性評價

1.4.1 菌懸液的制備

將一定量的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌接種至滅菌的培養基中，(36±1) ℃培養24 h，再用滅菌生理鹽水稀釋至103～105CFU·mL-1。

1.4.2 抑菌圈直徑的測定

采用濾紙片浸漬法測定抑菌圈直徑。將0.5 cm定性濾紙圓片置于離心管中，高壓滅菌后，干燥，備用。以滅菌生理鹽水稀釋丹參總黃酮提取濃縮液，分別配成梯度濃度1 mg·mL-1、5 mg·mL-1、10 mg·mL-1和20 mg·mL-1的丹參總黃酮溶液，過濾除菌后，加入含0.5 cm定性濾紙圓片的離心管中，浸泡30 min；超凈工作臺上，將滅菌培養基倒入培養皿中，紫外滅菌冷卻后，加入103～105CFU·mL-1菌懸液20 μL，涂布均勻；用無菌鑷子夾取浸有丹參總黃酮溶液的濾紙圓片，略干后放入培養皿中；將培養皿于36 ℃培養24 h，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，平行測定3次，結果取平均值。

2 結果與討論

2.1 丹參總黃酮提取工藝的優化

2.1.1 單因素實驗結果

2.1.1.1 料液比對丹參總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對丹參總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

從圖2可知，超聲提取法的丹參總黃酮提取率高于熱回流提取法，且超聲提取法的總黃酮提取率受料液比的影響較小。隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，兩種方法的總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1∶10時，總黃酮提取率最高。這是由于，溶劑乙醇用量增加，其與丹參細粉有效接觸的比表面積增大，促使黃酮類有效成分擴散并轉移至溶劑中，提取率快速提高；但溶劑用量過大時，溶質占比減小，黃酮類有效成分在溶劑中的比例降低，后處理過程中總黃酮損失增大，導致總黃酮提取率降低。

2.1.1.2 提取時間對丹參總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 提取時間對丹參總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

從圖3可知，基于熱效應、空化效應和機械效應，超聲提取法所耗時間較短、丹參總黃酮提取率略高。隨著提取時間的延長，兩種方法的總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢，且超聲提取法的總黃酮提取率下降趨勢比熱回流提取法的緩慢。當提取時間為30 min時，超聲提取法的總黃酮提取率達到最高；當提取時間為90 min時，熱回流提取法的總黃酮提取率達到最高。這是由于，溶劑與丹參細粉接觸時間延長促使溶劑充分浸潤丹參細粉，溶解至溶劑中的黃酮類有效成分增加，總黃酮提取率升高；但提取時間過長，總黃酮中的熱敏組分在高溫下會發生分解，導致總黃酮提取率下降。

2.1.1.3 提取溫度對丹參總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 提取溫度對丹參總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

丹參中的丹參酮ⅡA、丹酚酸B等物質含有醌類結構，在高溫下會發生氧化、聚合等反應，加熱溫度過高或時間過長會導致有效成分被破壞，因此，提取溫度對丹參總黃酮提取率的影響較大。從圖4可知，隨著提取溫度的升高，兩種方法的總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢，且相同提取溫度下，超聲提取法的總黃酮提取率高于熱回流提取法的。當提取溫度為65 ℃時，超聲提取法的總黃酮提取率達到最高；當提取溫度為75 ℃時，熱回流提取法的總黃酮提取率達到最高。這是由于，超聲波的空化作用和機械作用大大提高了溶劑與溶質的摩擦力和剪應力，促進有效物質快速溶解，而提取溫度過高，溶劑與溶質間的熱效應會導致總黃酮中的熱敏組分發生分解，使總黃酮提取率下降。

2.1.1.4 乙醇體積分數對丹參總黃酮提取率的影響(圖5)

從圖5可知，隨著乙醇體積分數的增大，兩種方法的丹參總黃酮提取率的變化趨勢基本一致，均呈先升高后略下降的趨勢，且超聲提取法的總黃酮提取率略高于熱回流提取法的。當乙醇體積分數為85%時，超聲提取法與熱回流提取法的總黃酮提取率均達到最高，分別為4.12 mg·g-1、3.82 mg·g-1；但繼續增大乙醇體積分數，總黃酮提取率反而下降。這是由于，丹參有效成分分為水溶性成分和脂溶性成分，若乙醇體積分數過低，脂溶性成分不能被充分溶解；而乙醇體積分數過高，水溶性成分溶解性降低，導致總黃酮提取率下降。

圖5 乙醇體積分數對丹參總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Salvia miltiorrhiza

2.1.2 響應面實驗結果

2.1.2.1 響應面實驗設計及結果

對比兩種提取方法的單因素實驗結果，超聲提取法總體優于熱回流提取法。以丹參總黃酮提取率為響應值，以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、乙醇體積分數(D)為自變量，設計4因素3水平響應面實驗，進一步優化丹參總黃酮的超聲提取工藝。響應面實驗的因素與水平如表1所示，設計及結果如表2所示。

表1 響應面實驗的因素與水平

表2 響應面實驗設計及結果

采用Design-Expert軟件對表2數據進行擬合，得到二次回歸方程：Y=4.14+0.0175A-0.0167B+0.0933C+0.0258D-0.0575AC+0.0500AD+0.0550BC-0.0550BD+0.0275CD-0.1779A2-0.1792B2-0.1767C2-0.1829D2，R2=0.9945。

回歸模型的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

從表3可知，模型P<0.0001，說明回歸模型高度顯著，模型擬合度高，實驗誤差較小。一次項B、交互項CD對丹參總黃酮提取率的影響顯著；一次項A的影響極顯著；一次項C、D，交互項AC、AD、BC、BD，二次項A2、B2、C2、D2的影響高度顯著。由F值可知，各因素對丹參總黃酮提取率影響的大小順序為：提取溫度(C)>乙醇體積分數(D)>料液比(A)>提取時間(B)。

2.1.2.2 最佳工藝的確定及驗證

通過Design-Expert軟件對二次回歸方程求一階導，得到最佳超聲提取工藝如下：料液比1∶10、提取時間22 min、提取溫度68 ℃、乙醇體積分數86%，丹參總黃酮提取率理論值為4.151 mg·g-1。在此條件下進行3次平行驗證實驗，總黃酮平均提取率為4.140 mg·g-1，相對平均偏差為0.10%，RSD值為0.14%，與理論值接近。

2.2 丹參總黃酮的抑菌活性

植物源黃酮可破壞細菌細胞壁膜的完整性及通透性，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有一定的抑制效果。通過測定抑菌圈直徑，考察不同濃度丹參總黃酮的抑菌活性，結果如表4所示。

表4 不同濃度丹參總黃酮的抑菌活性

從表4可知，丹參總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，丹參總黃酮的抑菌作用越強。在相同濃度下，丹參總黃酮對革蘭氏菌的抑制作用大小為：大腸埃希菌>金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌。因此，丹參總黃酮可作為天然抗菌劑進一步開發。

3 結論

通過單因素實驗對超聲提取法和熱回流提取法提取丹參總黃酮進行了比較研究，發現超聲提取法優于熱回流提取法，再通過響應面法進一步優化丹參總黃酮的超聲提取工藝，確定最佳超聲提取工藝為：料液比1∶10(g∶mL)、提取時間22 min、提取溫度68 ℃、乙醇體積分數86%，在此條件下，丹參總黃酮提取率為4.140 mg·g-1，與理論值(4.151 mg·g-1)接近。抑菌實驗結果表明，丹參總黃酮對革蘭氏菌的抑制作用大小為：大腸埃希菌>金黃色葡萄球菌>銅綠假單胞菌。