荷斯坦牛血漿催乳素濃度遺傳參數估計及其與PRL、PRLR和TRH基因關聯分析

高 清 胡麗蓉 張海亮 張 帆 楊 圳 林逍然 徐 青 郭 剛 劉巧香 王雅春*

(1.中國農業大學 動物科技學院/農業農村部動物遺傳育種與繁殖(家畜)重點實驗室/ 畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193； 2.北京交通大學 生命科學與生物工程研究院，北京 100044； 3.北京首農畜牧發展有限公司，北京 100029； 4.北京生物種業創新聯合體，北京 101206)

催乳素(Prolactin， PRL)，又稱促乳素或泌乳素，是一種單鏈多肽類激素，因最早被發現與乳腺發育、乳汁分泌密切相關而得名[1]。PRL與生物機體的300多種生物化學反應有關，包括促進乳腺發育和成熟、維持泌乳、促進性腺發育、參與調控性腺功能、調控生殖生理狀態、促進體細胞的增殖、調節免疫機能、維持水鹽平衡、維持內分泌和新陳代謝及調控行為等，被稱為“萬能激素”[2-4]。

PRL對奶牛乳腺發育和泌乳發揮著重要作用，促進乳腺導管及腺細胞的增殖分裂與發育成熟，調控泌乳的啟動與維持，調節乳汁中蛋白質、乳糖和脂肪的生成[5]。一定濃度的PRL可以顯著增加奶牛乳腺上皮細胞的增殖率，對細胞中信號轉導及轉錄因子、L型氨基酸轉運蛋白1、活化蛋白、酪蛋白等的表達以及細胞內乳脂和乳蛋白的合成有顯著促進作用[6-8]。研究發現，奶牛的胎次、日糧組成、季節、環境溫濕度和擠奶刺激等都會對血漿PRL濃度產生影響。有研究發現，血漿PRL濃度在8月、11月和1月之間差異極顯著，在熱應激狀態下顯著升高[9]；二胎和三胎奶牛的血漿PRL濃度顯著高于四胎奶牛[10]；擠奶前的泌乳刺激對催乳素釋放有促進作用[1]。此外，Lupoli等[11]還比較了哺乳奶牛與機器擠奶奶牛的PRL水平差異，哺乳奶牛的PRL濃度顯著高于機器擠奶的奶牛。日糧配方也是影響血漿催乳素水平的重要因素，在一定范圍內，蛋白質與賴氨酸占日糧的含量與催乳素濃度呈正相關關系[12]。

編碼催乳素的基因PRL已經被證實存在于所有的脊椎動物中，牛的PRL基因全長9 388 bp，位于第23號染色體上，包含5個外顯子和4個內含子[13]。細胞需要通過表面的催乳素受體(Prolactin receptor， PRLR)結合催乳素來接收信號，故催乳素受體對動物繁殖和泌乳等各種生理功能也會產生較大影響。在哺乳動物中，催乳素受體至少存在兩種形態，長型受體可以通過JAK2/STAT5 途徑來實現調節基因轉錄活性，短型受體則不具備該功能，但短型受體可以與長型受體結合形成異二聚體來抑制長型受體的活性，從而對基因的表達和轉錄產生影響。牛的PRLR基因位于第20號染色體，包含10個外顯子和9個內含子[14]。促甲狀腺激素釋放激素(Thyrotropin releasing hormone， TRH)主要作用于垂體，其受體分布于垂體促甲狀腺激素細胞及中樞神經系統，在PRL分泌細胞上也有分布，參與調控促甲狀腺激素和PRL的釋放[15]。研究表明，泌乳奶牛注射一定劑量TRH后，其血清中的PRL濃度會顯著升高[16]；在體外培養的牛腦垂體前葉細胞中添加TRH，細胞中PRL的合成顯著增加[17]。由于催乳素具有豐富的生物學功能，已有研究對PRL和PRLR基因和奶牛重要經濟性狀進行了關聯分析，發現多個與產奶量、乳脂和乳蛋白等顯著相關的位點[18-21]。然而，關于PRL、PRLR和TRH基因多態性與奶牛PRL濃度的關系尚未見報道。

因此，本研究對北京地區某規?；翀龅拿谌槠诤伤固古＿M行血漿PRL濃度測定，通過影響因素方差分析、遺傳分析和候選基因關聯分析等方法，揭示了不同環境條件和生理階段下奶牛PRL濃度及其變化規律，估計了奶牛血漿PRL濃度的遺傳參數，并分析了PRL、PRLR和TRH基因與奶牛PRL濃度之間的關系。本研究為探索牛血漿PRL濃度的遺傳基礎和開發育種新性狀做出了有益嘗試，為篩選具有重要功能分子標記提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗群體

本研究試驗群體來自北京市某規模化牧場，該牧場飼養的奶牛品種為荷斯坦牛。本研究在7個不同時期對試驗牛群進行了血液樣品采集，分別為2014年夏季(178頭)、2014年秋季(120頭)、2014年冬季(126頭)、2017年春季(194頭)、2017年夏季(284頭)、2017年秋季(116頭)、2017年冬季(151頭)。試驗牛的基本信息(出生日期、產犢時間、胎次和妊娠狀況等)和日產奶量記錄由牧場提供，系譜數據由北京奶牛中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1血樣采集及血漿PRL濃度測定

采集血樣時，使用一次性采血針和抗凝采血管采集泌乳期荷斯坦牛尾根靜脈血 20 mL，其中，10 mL血樣3 000 r/min離心15 min，使血漿與血細胞分離，取上層血漿裝入經過高壓滅菌的1.5 mL離心管中，冷凍保存于-40 ℃，用于測定PRL濃度。血漿PRL濃度由北京金?？朴缟锟萍加邢薰?北京)測定，測定方法為酶聯免疫法。另外10 mL抗凝血樣用于提取DNA。

1.2.2公牛DNA提取與DNA混池構建

選擇70 頭無親緣關系或親緣關系較遠的中國荷斯坦公牛，采用高鹽法提取公牛凍精DNA，經DanoDrop2000測定濃度后，隨機分為 3 組(20、20和30 頭)，依照凍精基因組DNA的濃度等量混合成3個池 DNA，于4 ℃保存備用，種公牛凍精來源于北京奶牛中心。

1.2.3基因多態篩查

下載PRL基因(ENSBTAG00000015274)和PRLR基因(ENSBTAG00000025035)外顯子及上下游各2 000 bp 調控區，TRH基因(ENSBTAG00000005306)全序列及上下游各2 000 bp調控區序列，采用NCBI網站的Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計引物。PRL、PRLR和TRH基因分別設計了6對、13對和9對引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以混池DNA為模板進行PCR擴增，所用PCR Mix為金牌Mix(北京擎科生物科技有限公司)，PCR反應體系為25 μL，包含1 μL DNA樣、22 μL PCR Mix及上下游引物各1 μL。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增成功后，將剩余的PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司測序。通過Chromas 2.4.3軟件查看測序峰圖及DNAMAN7.0軟件進行序列比對，以此判定基因多態性。

1.2.4母牛DNA提取與基因分型

使用DNA試劑盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)提取母牛血液DNA，檢測濃度后調整至50 ng/μL備用。從篩查到的基因多態位點中挑選出位于編碼區域或功能區域的位點，設計基因分型引物，采用競爭性等位基因特異性PCR基因分型技術(KASP)對400頭母牛進行分型，由中玉金標記(北京)生物技術股份有限公司完成。

1.3 數據整理

本研究于2014和2017年的不同季節測定了北京某規?；翀?72頭荷斯坦泌乳母牛共1 169條的血漿催乳素濃度數據，剔除奶?；拘畔⑷笔祿透黜椫笜藷o法對應的個體，共保留468頭牛的1 150條數據用于催乳素濃度的影響因素分析、遺傳參數估計及關聯分析。

本研究中，按照血樣采集的年份和季節(3～5月為春季，6～8月為夏季，9～11月為秋季，12～1月為冬季)，將采樣季節劃分為7個水平，分別為2014年夏季、2014年秋季、2014年冬季、2017年春季、2017年夏季、2017年秋季和2017年冬季；將胎次劃分為3個水平，分別為1胎、2胎和3胎及以上；將泌乳階段劃分為4個階段，分別為1～100 d(階段Ⅰ，泌乳前期)、101～200 d(階段Ⅱ，泌乳中期)、201～305 d(階段Ⅲ，泌乳后期)、306 d及以后(階段Ⅳ，泌乳末期)；將擠奶狀態劃分3個水平，分別為擠奶前、擠奶后和未知。

本研究中，根據有表型個體的牛號，利用北京地區荷斯坦牛群體的大系譜追溯用于血漿PRL濃度性狀遺傳分析的小系譜，最終本研究所用的系譜文件中包含公牛699頭和母牛2 531頭。

1.4 統計分析

1.4.1血漿PRL濃度影響因素分析

使用SAS 9.2軟件的MIXED過程，對可能影響血漿PRL濃度的非遺傳因素進行方差分析，采用 Bonferronit檢驗進行多重比較，考慮的因素如模型1所示：

Yijklm=μ+TIMEi+LACTj+STAGEk+ADl+idijklm+eijklm

(1)

式中：Yijklm為血漿催乳素濃度，mIU/L；μ為總體均值；TIMEi為采樣季節效應(i=1～7)；LACTj為胎次效應(j=1，2，3)；STAGEk為泌乳階段效應(k=1～4)；ADl為擠奶前后效應(l=1，2，3)；idijklm是個體隨機效應，eijklm為隨機殘差。

1.4.2血漿PRL濃度遺傳分析

基于DMU軟件的DMUAI程序，采用單性狀重復力模型估計血漿催乳素濃度的方差組分和遺傳力，保留1.4.1中顯著的非遺傳因素加入模型2，模型中包含的效應如下：

Yijkm=TIMEi+LACTj+STAGEk+peijkm+aijkm+eijkm

(2)

1.4.3血漿PRL濃度與基因PRL、PRLR和TRH關聯分析

使用SAS 9.2 軟件的MIXED過程，對血漿PRL濃度與基因PRL、PRLR和TRH的多態位點或單倍型進行關聯分析，保留1.4.1中顯著的非遺傳因素加入模型3，采用 Bonferronit檢驗進行多重比較，模型中包含的效應如下：

Yijklm=μ+TIMEi+LACTj+STAGEk+SNPl+idijklm+eijkm

(3)

式中：Yijklm表示血漿催乳素濃度(mIU/L)；TIMEi、LACTj、STAGEk表示的效應同模型1；SNPl是基因型效應或單倍型組合效應；idijklm是個體隨機效應，eijkm為隨機殘差。

2 結果與分析

2.1 非遺傳因素對血漿PRL濃度的影響

血漿PRL濃度的描述性統計結果如表1所示。本研究中，血漿催乳素濃度最大為371.28 mIU/L，最小為112.9 mIU/L，平均濃度為224.29 mIU/L，變異系數為20.9%。

表1 泌乳期荷斯坦牛血漿催乳素濃度描述性統計Table 1 Descriptive statistics of plasma prolactin concentration in lactating Holstein cattle

采用模型1分析了采樣季節、胎次、擠奶前后和泌乳階段對奶牛血漿PRL濃度的影響，分析結果表明，采樣季節和泌乳階段對血漿中PRL濃度有極顯著影響(P<0.01)，胎次對血漿PRL濃度有顯著影響(P<0.05)，而擠奶前后對血漿PRL濃度無顯著影響(P>0.05)，各效應不同水平最小二乘均值估計值及多重比較結果如表2所示。奶牛血漿PRL濃度隨胎次升高而升高，3胎及以上奶牛的PRL濃度顯著高于1胎，2個水平間相差11.1 mIU/L。在各個季節之間，奶牛PRL濃度表現出顯著差異；2014年內，夏季的血漿PRL濃度最高，較冬季的PRL濃度高了85.67 mIU/L；2017年內，奶牛在春季的PRL濃度最高，夏季次之，2個季節均處于較高水平，秋季濃度最低，較春季低了64.23 mIU/L。隨泌乳階段逐漸升高，奶牛血漿PRL濃度也逐漸升高；其中，階段Ⅰ(1～100 d)的PRL濃度顯著低于階段Ⅳ(泌乳天數在306 d及以后)，兩階段的血漿PRL濃度相差12.67 mIU/L。但在本研究中，奶牛在擠奶之前和擠奶之后的血漿PRL濃度無顯著差異。

表2 非遺傳因素對荷斯坦牛血漿催乳素濃度的影響Table 2 Effects of non-genetic Factors on plasma prolactin concentration of Holstein

2.2 血漿催乳素濃度遺傳力估計

利用單性狀重復力動物模型估計了血漿PRL濃度的遺傳參數，血漿PRL濃度的方差組分和遺傳參數如表3所示。由表3可知，荷斯坦牛血漿PRL濃度是一個低遺傳力性狀，其遺傳力估計值為0.02±0.04，重復力估計值為0.06。

2.3 基因PRL、PRLR和TRH多態位點與血漿PRL濃度的關聯分析

本研究共對15個SNP進行了母牛群體的分型，其中PRL基因4個，PRLR基因3個，TRH基因8個，各基因中SNP的rs號見表4。采用模型3分別對每個SNP與奶牛血漿PRL濃度進行了關聯分析，每個SNP僅保留基因型頻率高于0.03的基因型。結果顯示，TRH基因的位點rs109144892、rs108991567、rs109468305及rs109330999與血漿催乳素濃度極顯著相關(P<0.01)，TRH基因的rs137596325位點與血漿催乳素濃度顯著相關(P<0.05)，其余10個SNP與血漿催乳素濃度無顯著相關，各SNP不同基因型的血漿PRL濃度最小二乘均值估計值及多重比較結果如表4所示。

表3 荷斯坦牛血漿催乳素濃度方差組分及遺傳參數Table 3 Genetic parameters and variance components of plasma prolactin concentration in Holstein

基因PRL中，位點rs108970792為TT基因型的血漿PRL濃度較同位點其他基因型更低，但差異未達到顯著水平?；騎RH中， rs109144892位點為TT基因型個體的血漿PRL濃度極顯著高于CT，高出7.02 mIU/L； rs108991567位點為CC基因型個體的血漿PRL濃度極顯著高于TC，高6.91 mIU/L；rs109468305位點為TT基因型的血漿PRL濃度極顯著高于CT，高7.04 mIU/L；rs109330999位點為AA基因型個體的血漿PRL濃度極顯著高于TA，高6.95 mIU/L；rs137596325位點為AA基因型個體的血漿PRL濃度顯著高于A-，高9.27 mIU/L；rs135342429位點為AA基因型個體的血漿PRL濃度較GG高5.22 mIU/L，但差異未達到顯著水平。

表4 基因PRL、PRLR和TRH多態位點與血漿催乳素濃度的關聯分析Table 4 Association analysis of PRL, PRLR, and TRH polymorphic loci with plasma prolactin concentration

表4(續)

2.4 基因PRL、PRLR和TRH單倍型與血漿PRL濃度的關聯分析

使用Haploview 4.2軟件，采用系譜推斷法分別對基因PRL、PRLR和TRH的SNP進行連鎖不平衡分析(圖1)。本研究中，在基因PRL上確定了一個單倍型塊，命名為PRL Block，由rs108970792、rs384170723、rs110684599和rs110586822組成；在基因PRLR上確定了1個單倍型塊PRLR Block，由rs134638792和rs110971500組成；在基因TRH上確定了TRH Block1和TRH Block2 2個單倍型塊，TRH Block1由 rs137596325和rs381314916組成，TRH Block2由rs109144892、rs42602973、rs108991567、rs109468305和rs109330999組成。各單倍型塊中，單倍型的基因型及其頻率如表5所示。

圖1 PRL、PRLR和TRH基因的SNP連鎖不平衡分析Fig.1 SNP linkage disequilibrium analysis of PRL, PRLR, and TRH genes

表5 基因PRL、PRLR和TRH單倍型的基因型及其頻率Table 5 Genotype and frequency of haplotypes in gene PRL, PRLR and TRH

針對每個單倍型塊，僅保留數據量大于50的單倍型組合用于關聯分析，采用模型3對基因PRL、PRLR和TRH的4個單倍型塊進行了與血漿PRL濃度的關聯分析。結果顯示，單倍型塊PRL Block與血漿PRL濃度無顯著相關，單倍型塊PRLR Block與血漿PRL濃度具有顯著關聯的趨勢(P=0.08)；單倍型塊TRH Block1和TRH Block2均與血漿PRL濃度顯著關聯(P<0.05)，各單倍型塊中不同單倍型組合的血漿PRL濃度的最小二乘均值及多重比較結果如表6所示。

基因PRLR中，單倍型H2H2的血漿PRL濃度最高，為251.97 mIU/L，較單倍型H2H3(241.87 mIU/L)高10.10 mIU/L。基因TRH的單倍型塊TRH Block1中，H2H2的血漿PRL濃度最高，為251.28 mIU/L，較H1H2(241.66 mIU/L)和H1H3(241.13 mIU/L)分別高9.6和10.15 mIU/L；TRH Block2中，單倍型組合H2H2的血漿PRL濃度顯著高于組合H1H2，高10.04 mIU/L。

3 討 論

本研究發現，采樣季節對奶牛血漿PRL濃度有極顯著影響，在春季、夏季時奶牛血漿PRL濃度比秋冬季節更高，奶牛為抵抗春末和夏季的熱應激增加了催乳素的分泌。在胡麗蓉等[9]的研究中，在熱應激狀態、非應激狀態和冷應激狀態下，奶牛血漿PRL水平有極顯著差異，且熱應激狀態下血漿PRL濃度顯著高于其他狀態，這與本研究結果一致。本研究中，胎次和泌乳階段對血漿PRL濃度有顯著或極顯著水平的影響，并隨胎次和泌乳階段的推移而逐漸升高。在韓英東等[10]的研究中，泌乳階段對PRL無顯著影響，胎次對泌乳牛血液PRL含量有顯著的影響，但該研究2胎和3胎奶牛的血液PRL含量顯著高于4胎奶牛，與本研究結果相反。值得注意的是，該研究采用放射免疫法測定了血液中PRL含量，且該研究的數據量小于本研究。

表6 基因PRL、PRLR和TRH單倍型塊與奶牛血漿催乳素濃度的關聯分析Table 6 Association analysis of PRL, PRLR and TRH haploblock with plasma prolactin concentration

本研究群體中，共發現了PRL基因的rs108970792、rs384170723、rs110684599和rs110586822等4個SNP。通過基因分型和關聯分析，上述4個SNP與血漿PRL濃度均無顯著相關。其中，rs384170723、rs110684599和rs110586822均位于PRL基因的上游區域，因此本研究推測這3個SNP對PRL基因的表達無明顯調控作用。位點rs108970792位于外顯子5，為同義突變，不改變氨基酸序列。本研究群體中，位點rs108970792的TT基因型的基因型頻率僅為0.04，且該基因型個體的血漿PRL濃度比其他2種基因型更低。隨著對同義突變的認識逐漸深入，發現同義突變會影響除了蛋白質序列外的很多生物學過程，比如轉錄因子的識別，mRNA的剪接、折疊和降解，以及蛋白質翻譯的起始、效率和準確性等[22-24]。最新研究表明[25]，在釀酒酵母中，至少75%的同義突變會顯著損害其適應度。同義突變導致生物對環境的適應能力下降可能也是rs108970792位點TT基因型個體在本研究群體中極少的原因。

在PRLR基因上，本研究群體中共發現rs135164815、rs134638792和rs110971500等3個SNP。上述3個位點與血漿PRL濃度均無顯著關聯。其中，rs135164815位點位于PRLR基因的第5外顯子，為錯義突變，會引起第18個氨基酸由絲氨酸變成天冬酰胺，本研究群體中僅有1頭奶牛該位點為AG基因型。在芬蘭愛爾夏牛群體中，該SNP位點會顯著影響奶牛的產奶量、乳蛋白產量和乳脂產量[26]；此外，基因PRLR的變異與牛胚胎存活率、種公牛繁殖力顯著相關[27-28]。考慮到催乳素在奶牛繁殖和泌乳中扮演的重要作用，我們猜測rs135164815位點突變可能會影響催乳素的分泌或信號傳導，一方面影響奶牛產奶性能導致奶牛被人為淘汰，另一方面影響奶牛繁殖，造成突變個體適應能力降低。位點rs110971500位于PRLR第10外顯子，為同義突變，本研究群體中該位點AA基因型的基因型頻率僅為0.03。本研究還發現，由同義突變位點rs134638792和內含子突變位點rs110971500組成的單倍型塊PRLR Block與血漿PRL濃度存在一定關聯性，單倍型組合H2H2的血漿PRL濃度較H2H3高10.10 mIU/L，H2H2組合為位點rs108970792的CC基因型，H2H3組合則是該位點的CA基因型，說明rs108970792突變與催乳素的分泌有一定關系。

在TRH基因上，本研究共發現rs135342429、rs137596325、rs381314916、rs109144892、rs42602973、rs108991567、rs109468305和rs109330999等8個SNP。位點rs137596325與血漿PRL濃度顯著相關，且AA基因型個體的PRL濃度最高。rs381314916位點位于TRH基因外顯子2上的5’UTR，與血漿PRL濃度無顯著相關，本研究群體中該位點的CC基因型的基因型頻率僅為0.04。連鎖不平衡分析中，rs137596325和rs381314916位點共同組成了TRH Block1，并與血漿PRL濃度顯著相關，單倍型組合H2H2個體的PRL濃度最高，H1H1次之，H2H2和H1H1組合中均包含位點rs137596325的AA基因型。TRH基因的位點rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999與血漿PRL濃度極顯著相關，其PRL濃度最高的基因型分別為TT、CC、TT和AA，上述4個位點與 rs42602973共同組成了單倍型塊TRH Block2，TRH Block2與血漿PRL濃度顯著相關，單倍型H2H2個體的血漿PRL濃度最高，H2H3次之；而H2H2、H2H3正是位點rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999血漿PRL濃度最高的基因型與位點rs42602973上2個高頻基因型的組合，單位點關聯分析和單倍型組合關聯分析相互佐證。有研究表明，促甲狀腺激素釋放激素對催乳素的分泌起著重要調控作用[15]，泌乳牛注射TRH的活體試驗[16]和體外培養的細胞試驗[17]也證明了該結論。上述各位點中，rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999位于TRH基因上游，rs137596325位點位于TRH基因下游，已有研究表明[29-30]，基因上下游的序列可能存在與基因表達調控有關的調控元件，具有增強或減弱轉錄活性的作用。由此可以推斷，基因TRH中位點rs137596325、rs109144892、rs108991567、rs109468305和rs109330999的突變可能通過影響TRH的分泌，進而調節奶牛催乳素的分泌。

4 結 論

本研究發現，泌乳期荷斯坦牛的血漿催乳素(PRL)濃度是一個低遺傳力性狀，受采樣季節、胎次和泌乳階段的顯著影響?；騊RL和PRLR中未發現與血漿PRL濃度顯著相關的SNP；TRH基因的位點rs109144892、rs108991567、rs109468305、rs109330999和rs137596325與血漿PRL濃度顯著相關。單倍型關聯分析發現，基因PRLR上的單倍型塊與血漿PRL濃度有一定關聯性，基因TRH上的2個單倍型塊與奶牛血漿PRL濃度顯著相關。本研究通過系統的遺傳學分析獲得了荷斯坦牛血漿PRL濃度的群體特征和遺傳參數，探究了與血漿PRL濃度分泌相關基因的多態性及其與血漿PRL濃度的關聯情況，為研究奶牛血漿PRL濃度的遺傳基礎提供參考。