不同水平單寧復合蛋白對黃羽肉雞免疫功能、抗氧化能力以及脂代謝的影響

范秋麗 陳志龍 譚淑君 王君雁 茅沈麗 林澤鈴 蔣守群

(廣東省農業科學院 動物科學研究所/畜禽育種國家重點實驗室/農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室/ 廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640)

自國內禁止飼用促生長類的抗生素以來，各種可作為飼料添加劑的植物提取物的開發與應用已成為研究熱點。其中單寧酸是一類植物提取的多酚化合物，因含酚羥基結構，具有抗氧化、抑菌和抗病毒等生物活性功能：鼠料中添加0.3%和0.6%的單寧酸可升高青春期和成年期布氏田鼠機體抗氧化能力[1]；250和500 mg/kg單寧酸可降低黃曲霉毒素感染條件下42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數量，提高乳酸桿菌數量[2]；單寧酸對甲型流感病毒、乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒和諾如病毒等均具有生物活性[3]。雖然單寧酸具有以上正向的生物學功能，但也有研究表明其與唾液蛋白結合，可在口腔中產生澀味，降低采食量，需與蛋白質結合形成單寧復合蛋白以緩解此負面影響[4]。單寧復合蛋白是天然植物提取的單寧酸和蛋白質沉淀結合形成的復合物，又名鞣酸蛋白或植物多酚蛋白，外觀呈淡棕色或淡黃色粉末，無臭無味，具有收斂作用，其與腸黏膜表面蛋白凝固形成保護膜，可緩解腸道刺激、減少滲出，已被開發為各種產品應用于預防和治療不同原因引起的小兒腸炎和腹瀉[5-6]。目前，在畜牧生產方面，單寧復合蛋白的應用研究主要集中在斷奶仔豬抗腹瀉方面，宋妍妍[7]在研究單寧復合蛋白在斷奶仔豬上的有效性和耐受性時發現，0.2%～0.8%單寧復合蛋白均顯著降低仔豬腹瀉率和腹瀉指數，但關于單寧復合蛋白在肉雞生產中的研究目前尚無報道。因此，本研究以1～48日齡快大型麻黃肉雞為對象，研究了小麥豆粕花生粕型飼糧中添加不同水平的單寧復合蛋白對其生長性能、血漿生化指標、免疫功能、抗氧化能力以及脂代謝的影響，為其在肉雞健康養殖中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1日齡快大型麻黃肉公雛購自佛山市某雞苗公司。單寧復合蛋白有效含量≥85%，由單寧和大豆蛋白在體外沉淀復合，經干燥而成的單寧蛋白復合物，由肇慶市某生物科技有限公司提供。飼用復合小麥酶購自武漢某生物股份有限公司。

1.2 試驗設計

540只初始體重為(40.33±0.05) g且健康狀況良好的1日齡快大型麻黃肉公雛，根據體重一致原則隨機分為3個處理組，分別為基礎飼糧添加0、300和500 mg/kg單寧復合蛋白，每組6個重復，每個重復30只，每重復為1欄。試驗期48 d，分前期1～21日齡、中期22～42日齡和后期43～48日齡3個階段飼養。

1.3 試驗飼糧

試驗飼糧為小麥-豆粕-花生粕型，營養水平參考《黃羽肉雞營養需要量》(NY/T 3645—2020)中的飼料原料營養成分含量和快速型商品黃羽肉雞各生長階段營養需要標準科學配制，不同處理組相同飼養階段營養水平保持一致(表1)，各階段預混料中分別添加300 mg/kg飼用復合小麥酶。

1.4 飼養管理

試驗于2021年12月1日在廣東省農業科學院動物科學研究所試驗場開展，試雞平養于封閉式雞舍，地面鋪放谷殼，自由采食顆粒料和飲水，各處理組飼養管理和環境條件一致，每天自然通風，保持雞舍清潔衛生。按照常規操作程序和免疫流程進行飼養和免疫。每天觀察雞只健康狀況、糞便情況、采食量、死亡只數、死亡雞重量以及死亡原因，記錄雞舍每天的天氣情況以及8:00、12:00和17:30的溫度、濕度情況。

1.5 樣品采集與制備

2022年1月17日試驗結束當天20:00斷料供水，次日08:00以重復欄為單位稱肉雞空腹重量，稱重當天每欄挑選2只接近平均重的雞翅靜脈采集全血4 mL于加有肝素鈉的抗凝管中，3 500 rpm/min離心10 min，取血漿分裝于0.5 mL離心管中備測血漿生化指標、細胞因子含量、抗氧化指標和脂代謝相關指標。

采血后試雞頸部放血致死，剖取空腸，距中間部位10 cm處剪開，磷酸鹽緩沖液沖洗內容物后平鋪于干凈的濾紙上，載玻片刮取黏膜組織于1.5 mL滅菌離心管中備測細胞因子含量。取肝臟組織，每只雞取相同肝臟部位約1 g裝于滅菌的1.5 mL離心管中備測抗氧化和脂代謝相關指標。以上血漿、空腸黏膜組織、肝臟組織樣品采集時置于液氮中速凍，樣品采集結束后當天轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.6 指標測定

1.6.1生長性能指標測定

48日齡試驗結束前1天18:00斷料供水，次日07:00以欄為重復單位稱重，計算體重(BW)、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和死亡率(Mortality)等生長性能指標，具體計算參考范秋麗等[8]所述方法。

1.6.2血漿生化指標測定

采樣結束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品，冰上解凍后測定血漿生化指標。谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、葡萄糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)等血漿生化指標測定試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所，詳細測定步驟和結果計算方法參照試劑盒說明書，各指標讀數均在多功能酶標儀(SYNERGY H1，BioTek公司，美國)上操作。

1.6.3血漿和空腸黏膜細胞因子含量測定

采樣結束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品，冰上解凍后測定血漿細胞因子含量。γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)等血漿細胞因子測定試劑盒購買于北京方程生物科技有限公司，各指標具體測定方法和結果計算依據說明書進行。

采樣結束后-80 ℃冰箱取出空腸黏膜樣品，冰上解凍后制備空腸黏膜勻漿液，空腸黏膜10%勻漿液的制備和總蛋白含量的測定參考范秋麗等[8]所述方法，主要用儀器為全自動樣品冷凍研磨儀和離心機。IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和白細胞介素22(IL-22)含量測定方法同血漿細胞因子含量測定方法，各指標讀數均在多功能酶標儀上操作。

1.6.4血漿和肝臟抗氧化指標測定

采樣結束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品，冰上解凍后測定血漿抗氧化指標。血漿微量丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)的測定參考范秋麗等[8]所述方法，試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。采樣結束后-80 ℃冰箱取出肝臟樣品，冰上解凍后制備肝臟勻漿液，10%肝臟勻漿液的制備方法和總蛋白含量測定方法同空腸黏膜，抗氧化指標測定方法同血漿，各指標讀數均在多功能酶標儀上操作。

1.6.5血漿和肝臟脂代謝相關指標測定

采樣結束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品和制備好的10%肝臟勻漿液，測定脂代謝相關指標。血漿和肝臟雌二醇(E2)含量以及脂肪合成酶(FAS)活性試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司，測定步驟和方法參考說明書。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的測定參考Cui等[9]所述方法，各指標讀數均在多功能酶標儀上操作。

1.7 數據統計分析

采用SAS 9.2軟件中的GLM程序對試驗數據進行單因素方差分析，當處理效應差異顯著(P<0.05)時進行Duncan氏多重比較。各表格中數據以平均值和均值標準誤表示。

表1 基礎飼糧原料組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Ingredients composition and nutrient levels of basal diets (DM basis)

2 結果與分析

2.1 不同水平的單寧復合蛋白對1～48日齡黃羽肉雞生長性能的影響

由表2可知，對照組、單寧復合蛋白1、2組之間肉雞體重、平均日增重、平均日采食量、料重比和死亡率均差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿生化指標的影響

由表3可知，單寧復合蛋白1、2組肉雞血漿中ALT酶活性和UA含量均顯著高于對照組(P<0.05)，單寧復合蛋白2組血漿中GLU含量顯著低于對照組(P<0.05)，單寧復合蛋白1組血漿中TBIL含量顯著低于對照組(P<0.05)。不同處理組之間肉雞血漿中AST酶活性和Cr含量均差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同水平的單寧復合蛋白對1～48日齡黃羽肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of different levels of tannalbin on growth performance of yellow-feathered chickens at 1 to 48 days of age

表3 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿生化指標的影響Table 3 Effects of different levels oftannalbin on plasma biochemical indices of yellow-feathered chickens at 48 days of age

2.3 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和空腸黏膜細胞因子含量的影響

由表4可知，與對照組相比，單寧復合蛋白1組空腸黏膜中IL-1β含量降低，單寧復合蛋白2組空腸黏膜中IL-1β含量升高，但差異均不顯著(P>0.05)；單寧復合蛋白1組空腸黏膜中IL-6含量顯著降低(P<0.05)。不同處理組之間血漿中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均差異不顯著(P>0.05)，同時，空腸黏膜中IFN-γ、TNF-α和IL-22含量在不同處理組之間也差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和空腸黏膜細胞因子含量的影響Table 4 Effects of different levels of tannalbin on cytokine content in jejunal mucosa of yellow-feathered chickens at 48 days of age

2.4 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟抗氧化能力的影響

由表5可知，與對照組相比，單寧復合蛋白2組肉雞血漿中MDA含量顯著降低，同時肝臟中T-AOC 能力和GSH含量均顯著升高(P<0.05)。不同處理組之間血漿中T-SOD酶活性、T-AOC能力、GSH含量和肝臟中MDA含量以及T-SOD酶活性均差異不顯著(P>0.05)。

表5 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟抗氧化能力的影響Table 5 Effects of different levels of tannalbin on plasma and liver antioxidant capacity of yellow-feathered chickens at 48 days of age

2.5 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟脂質代謝的影響

由表6可知，與對照組相比，單寧復合蛋白1、2組肉雞肝臟中E2、TG、TC和LDL-C含量以及FAS活性均顯著降低(P<0.05)。不同處理組之間血漿中E2、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量、FAS活性以及肝臟中HDL-C含量均差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟脂質代謝的影響Table 6 Effects of different levels of tannalbin on plasma and liver lipid metabolism of yellow-feathered chickens at 48 days of age

3 討 論

3.1 不同水平的單寧復合蛋白對1～48日齡黃羽肉雞生長性能的影響

雖然形成不同單寧復合蛋白的單寧酸因來源不同化學結構也不同，但其與蛋白質結合的性質是統一的，且在動物腸道內主要由單寧酸發揮生理功能[10]。單寧酸能夠減緩腸道蠕動，增加飼料在動物腸道內的停留時間，在一定程度上緩解了由于單寧酸與消化酶或多糖結合，減少了腸道對飼糧中養分消化吸收的不利影響[11]。宋妍妍[7]研究單寧復合蛋白在斷奶仔豬上的有效性和耐受性，結果表明，0.1%～0.8%單寧復合蛋白對生長性能影響不顯著。李軍輝等[12]研究飼糧分別添加200和400 mg/kg單寧酸對1～42日齡AA肉雞影響，結果表明，單寧酸的添加對生長性能影響不顯著。本研究結果顯示，不同水平單寧復合蛋白對1～48日齡肉雞生長性能影響不顯著，此結果與前人研究結果一致，說明單寧復合蛋白在改善肉雞生長性能方面無顯著效果。

3.2 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿生化指標的影響

血液生化指標可在一定程度上反映營養物質在機體中的代謝情況[13]。ALT酶和AST酶均在肝細胞漿中合成，其活性的高低可用來評估機體肝臟的損傷情況，當肝細胞受到損壞時，此兩者酶在血液中活性增加[14]。Zhang等[2]研究表明，250和500 mg/kg單寧酸可分別降低黃曲霉毒素B1誘導下21和42日齡肉雞血漿中ALT酶活性。Mansoori等[15]研究表明，20 g/kg單寧酸可降低肉雞血清中ALT酶和AST酶活性。本研究結果顯示，相比300 mg/kg單寧復合蛋白，500 mg/kg單寧復合蛋白的添加可顯著升高48日齡肉雞血漿中ALT酶活性，與前人研究結果不同之處可能與添加物的有效成分含量和試驗處理方法不同有關。UA是禽類嘌呤代謝的終產物，其濃度的高低反映了動物體內蛋白質和氨基酸的平衡狀況[16]。本研究結果顯示，300和500 mg/kg單寧復合蛋白的添加均顯著升高了肉雞血漿UA含量，此結果與宋妍妍[7]研究的0.8%的單寧復合蛋白顯著降低斷奶仔豬粗蛋白質消化率結果相似，說明本試驗條件下，單寧復合蛋白的添加使肉雞體內蛋白質代謝受到抑制。血液GLU、Cr和TBIL含量升高，機體對葡萄糖的代謝減緩，且腎臟和肝臟存在一定程度代謝障礙，導致機體無法代謝肌酐和膽紅素，從而使其在血液中含量增加[17]。茍昌勇[18]研究了700、1 200和1 700 mg/kg五倍子單寧酸對斷奶仔豬的影響，結果表明，不同水平的單寧酸對血清GLU含量影響不顯著。本研究結果顯示，500 mg/kg單寧復合蛋白顯著降低了血漿GLU含量，同時300 mg/kg單寧復合蛋白降低了血漿TBIL含量，說明不同水平的單寧復合蛋白對肉雞養分代謝均有一定的負面影響，但高劑量的單寧復合蛋白可改善肉雞糖代謝。

3.3 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞免疫功能的影響

炎癥反應是正常免疫反應的重要組成部分，是機體對病原微生物感染、創傷和變態反應等發生的細胞反應，其中促炎細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎細胞因子如IL-10、IL-22的平衡反映了炎癥反應的凈效應[19]，促炎細胞因子升高，炎癥反應增強，機體免疫功能下降[20]。研究表明，單寧酸降低炎癥反應的途徑主要有2種：一種是抑制炎癥信號通路和肥大細胞的活化[21-22]；另一種是單寧酸與腸道內蛋白質結合，對黏膜形成保護屏障，從而降低組織損傷和炎癥反應[23]。Kawano等[24]體外研究表明，單寧酸通過減少結腸免疫細胞分泌IFN-γ和IL-1β抑制結腸炎炎癥反應。本研究結果顯示，300 mg/kg單寧復合蛋白可降低48日齡肉雞空腸黏膜促炎細胞因子IL-1β和IL-6含量，說明單寧復合蛋白可通過抑制炎癥反應提高肉雞免疫功能，但有關作用機理還需進一步探究。

3.4 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞抗氧化能力的影響

機體的酶促抗氧化系統和非酶促抗氧化系統可避免因外源性和內源性自由基的攻擊對機體造成的損傷，其中T-SOD、T-AOC和GSH是酶抗氧化系統的組成部分[25]。因單寧酸含多元酚羥基結構，可通過提供氫離子和調控細胞Nrf2/ARE信號通路有效地清除自由基[26-27]，所以，可判斷單寧復合蛋白也具有抗氧化功能。研究表明，0.4%的單寧復合蛋白可提高斷奶仔豬血清中過氧化氫(CAT)酶活性，同時2%單寧復合蛋白可降低回腸黏膜中MDA含量[7]。本研究結果顯示，500 mg/kg單寧復合蛋白可降低血漿中MDA含量，同時升高肝臟中T-AOC酶活性和GSH含量，此結果與魏海峰等[28]在患有糖尿病大鼠上的研究結果相似，單寧酸可通過降低大鼠血清和腎臟MDA含量，升高T-SOD酶和CAT酶活性提高糖尿病大鼠抗氧化能力。同時，本研究中300和500 mg/kg單寧復合蛋白對肝臟T-SOD活性有升高的趨勢，說明單寧復合蛋白的添加可提高肉雞總抗氧化能力，且高劑量組效果優于低劑量組。

3.5 不同水平的單寧復合蛋白對48日齡黃羽肉雞脂質代謝的影響

肝臟是禽類脂肪代謝的重要場所，肝臟中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量可作評價機體脂肪代謝的重要指標，且多酚類化合物可通過降低雌激素維持的高血脂作用，達到降脂目的[29]。聶方園[30]研究發現，單寧酸可抑制細胞內脂肪酸合酶的活力及表達，同時抑制細胞活力，從而調控脂代謝。本研究結果顯示，300和500 mg/kg單寧復合蛋白均可顯著降低肝臟中雌二醇含量和脂肪合成酶活性，與上述研究結果相似。曾麗榮[31]研究表明，50和150 mg/kg/d單寧酸以劑量依賴性顯著降低高脂飲食小鼠肝臟和脂肪組織重量，同時降低血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量。本研究結果顯示，300和500 mg/kg單寧復合物均可顯著降低48日齡肉雞肝臟中TG、TC和LDL-C含量，與前人研究結果相似，說明單寧復合蛋白可通過降低肝臟內雌二醇含量和脂肪酶合成酶活性調節肉雞脂代謝，但300 mg/kg單寧復合蛋白和500 mg/kg單寧復合蛋白在調節脂代謝方面的效果差異不顯著。

4 結 論

①小麥豆粕型飼糧添加不同水平的單寧復合蛋白對1～48日齡快大型黃羽肉雞生長性能影響不顯著。

②綜合生長性能、免疫功能和脂代謝相關指標，本試驗條件下，小麥豆粕型飼糧中單寧復合蛋白的適宜添加量為300 mg/kg。