八倍體草莓DNA指紋圖譜的構(gòu)建與初步遺傳分析

劉國霞 張全芳 楊 雪 譚晴晴 胡 悅 范陽陽 姚 川 崔 剛 步 迅 陳雪燕* 劉炳福

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，濟(jì)南 250100； 2.山東普朗特農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司，濟(jì)南 250100； 3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 休閑農(nóng)業(yè)研究所，濟(jì)南 250100)

草莓(FragariaananassaDuch.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，因其獨特的風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價值素有“水果皇后”的美譽(yù)[1]。中國是世界上草莓主要生產(chǎn)國之一，2020年我國草莓栽培面積和產(chǎn)量分別為12.66萬hm2和332.68萬t，占世界種植面積和產(chǎn)量的32.92%和37.54%[2]。我國野生草莓資源豐富，自然分布的草莓屬植物約有13種，分別為二倍體和四倍體[3]，20世紀(jì)初八倍體的栽培草莓鳳梨草莓傳入我國[4]，目前為止已從國外引進(jìn)八倍體草莓品種上百個，其中以日本品種和歐美品種居多[5]。近年來我國自主繁育的品種逐年增加，截至2017年，我國草莓育種單位育成品種112個[6]。由于我國草莓種植區(qū)分布廣泛，不同地區(qū)均存在引種現(xiàn)象，品種命名混亂，加上草莓本身的營養(yǎng)繁殖特性，同名異物或同物異名的現(xiàn)象時有出現(xiàn)[4]。因此，使用分子技術(shù)手段準(zhǔn)確區(qū)分現(xiàn)有草莓品種資源很有必要。

利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建DNA指紋圖譜，能夠從遺傳本質(zhì)層面對品種進(jìn)行鑒別和保護(hù)，中國已將利用DNA指紋圖譜輔助草莓新品種測試列為重要發(fā)展方向[7]。簡單重復(fù)序列標(biāo)記(Simple sequence repeat，SSR)具有多態(tài)性豐富和穩(wěn)定性好等特點，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了大量SSR標(biāo)記用于草莓品種鑒定[4]、遺傳多樣性分析[8-9]及指紋圖譜構(gòu)建[10-12]等研究。傳統(tǒng)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物需要經(jīng)過銀染顯色等復(fù)雜工序，步驟繁瑣費時，而毛細(xì)管電泳熒光檢測方法具有操作簡便和靈敏度高的優(yōu)勢，可克服這一難題。本研究擬利用最新SSR引物結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)對收集的84個八倍體草莓資源進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳分析，以期為草莓資源保護(hù)、品種鑒定和新品種選育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括歐美、日韓及我國選育草莓品種，共計84份。現(xiàn)種植于山東普朗特農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司，樣品信息見表1。

1.2 DNA提取與PCR反應(yīng)

取草莓幼嫩葉片，加入液氮，用組織研磨儀研磨成粉末，采用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA用適量TE緩沖液溶解，使用微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，置于-20 ℃保存。

參考苗立祥等[13]的研究方法，選用59對引物對部分樣品進(jìn)行擴(kuò)增。選擇條帶清晰、單一和擴(kuò)增多態(tài)性較好的18對引物對所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物連接M13引物序列，以便與熒光標(biāo)記的M13引物進(jìn)行互補(bǔ)配對。M13引物序列參考賈琳琳等[14]。普通引物和熒光引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系總體積20 μL：10×Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 μmol/L M13熒光引物1 μL，1 μmol/L上下游引物mix 1 μL，DNA模板2 μL，用去離子水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃模板預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；95 ℃模板變性1 min，62 ℃～52 ℃每循環(huán)降低1 ℃，72 ℃引物延伸45 s，共10個循環(huán)；95 ℃模板變性1 min，52 ℃復(fù)性結(jié)合45 s，72 ℃引物延伸45 s，共25個循環(huán)；最后60 ℃延伸30 min，16 ℃保存。PCR結(jié)束后，取產(chǎn)物1～2 μL，加入含有ROX500內(nèi)標(biāo)的甲酰胺10 μL，95 ℃變性5 min，在ABI 3730XL DNA分析儀上進(jìn)行熒光檢測。檢測結(jié)果通過GenemapperV4.0軟件進(jìn)行片段大小和基因型分析。

表1 本研究所用的84份草莓資源信息Table 1 Information of 84 strawberry resources used in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

檢測產(chǎn)物明顯峰值按照四舍五入取整數(shù)記錄片段大小，將這些引物擴(kuò)增主要片段帶型進(jìn)行組合，即為品種的DNA指紋圖譜。將數(shù)據(jù)通過DataFormater2.7軟件轉(zhuǎn)換為NTSYS軟件要求的數(shù)據(jù)格式[15]。利用NTSYSpc 2.1軟件(http:∥www.appliedbiostat.com/) SM (Simple matching)法計算其遺傳相似系數(shù)，然后根據(jù)相似系數(shù)用SAHN Clustering和非加權(quán)成對算術(shù)平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean， UPGMA)進(jìn)行聚類分析[12]。多態(tài)信息含量(Polymophism information content, PIC)為某一標(biāo)記在群體中出現(xiàn)的頻率，反映該標(biāo)記在群體檢測多態(tài)性的價值[16]。根據(jù)Nei[17]方法計算引物PIC值：PIC=1-ΣPi2，其中Pi為第i等位變異的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選與多態(tài)性分析

選用DNA提取量較大，編號為9～15的7個草莓樣品對59個SSR引物進(jìn)行篩選。經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測，選出18對多態(tài)性好和擴(kuò)增信號強(qiáng)的引物，引物名分別為：S0011、S0051、S0061、S0121、S0181、S0231、S0291、S0301、S0331、S0341、S0351、S0471、S0491、S0611、S0641、S0701、S0791和S0971，這些引物分別編號P1～P18。每對引物擴(kuò)增產(chǎn)物相對片段大小基本與此前苗立祥等[13]研究公布的一致(表2)。引物P10和P11在部分草莓品種中檢測的不同類型的等位變異峰見圖1。樣品‘紅太后’‘宮本7號’‘綏陵’‘胡得’經(jīng)引物P10擴(kuò)增得到的帶型組合分別為205、192/266、260/266和205/272，而‘賀登’‘新星2號’‘靜香’‘肇國’經(jīng)引物P11擴(kuò)增得到的帶型組合分別為200/223、197、195/250和223/250。

表2 擴(kuò)增多態(tài)性信息所用18對引物Table 2 Polymorphic amplification information of the 18 primers used

圖1 引物P10(a)和P11(b)對部分草莓樣品擴(kuò)增峰圖Fig.1 Amplified profiles of primer P10 (a) and P11 (b) from some strawberry samples

使用18對 SSR 熒光標(biāo)記引物對84份草莓品種進(jìn)行擴(kuò)增，共得到156個條帶。其中多態(tài)性條帶150個，不同引物擴(kuò)增到的多態(tài)性條帶數(shù)為4～17個，多態(tài)性條帶帶型總數(shù)為377個。采用遺傳多樣性分析各引物的PIC值范圍為0.494～0.908，平均值為0.738(表2)。說明這些引物多態(tài)性較高，可用于對這些草莓品種進(jìn)行多態(tài)性分析。

2.2 84個草莓品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫的建立

為便于記錄，將18對SSR引物P1～P18分別編號為A～R，每對引物在84個草莓品種中擴(kuò)增出的帶型，按照條帶的個數(shù)從少到多(條帶個數(shù)相同的按照分子量從小到大)排序，依次將不同的帶型標(biāo)注為1、2、3、…，再將每個品種在18對引物上擴(kuò)增帶型進(jìn)行對應(yīng)的數(shù)字編碼[18]，將引物編號與相應(yīng)的帶型編碼進(jìn)行組合得到該樣品在特定引物的擴(kuò)增產(chǎn)物編碼，18對引物順序串聯(lián)這些編碼形成該品種的DNA指紋圖譜。如P1共擴(kuò)增帶型數(shù)20個，按照以上原則進(jìn)行編號分別為1：250，2：254，3：258，4：262，5：241/250，6：241/254，7：241/258，8：241/262，9：243/250，10：243/254，11：243/258，12：243/262，13：243/278，14：250/254，15：250/258，16：250/262，17：254/258，18：254/262，19：258/262，20：258/266。例如：1號樣品‘小桃紅’由P1擴(kuò)增到多態(tài)性帶型為250/254，對應(yīng)第14種帶型，因此引物P1對‘小桃紅’擴(kuò)增帶型編碼為A14；引物P2共擴(kuò)增帶型數(shù)24個，該引物擴(kuò)增‘小桃紅’的帶型為176/185/188/197，對應(yīng)第17種帶型，則引物P2對‘小桃紅’擴(kuò)增帶型編碼為B17。按照同樣原則，將其他引物對‘小桃紅’的擴(kuò)增帶型進(jìn)行編碼，按照P1～P18引物順序?qū)途幋a進(jìn)行組合，得到‘小桃紅’的指紋代碼為A14B17C25D5E10F4G15H8I17 J1K7L18M7N35O14P12Q6R1。按照此方法建立了84個草莓品種的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。

2.3 聚類分析

基于18對SSR引物對84份草莓品種進(jìn)行聚類分析(圖2)表明，84份草莓品種資源的遺傳相似系數(shù)范圍為0.61～0.99，一些品種之間相似系數(shù)接近0.99，如‘紅富美’‘紅珍珠’、‘福特拉米’‘紅太后’和‘胡得’‘格林1號’。聚類結(jié)果顯示一些來源接近的品種聚在一起，如紅花草莓‘小桃紅’‘粉佳人’，我國的地方品種‘丹東大果’‘石頭河子’聚在一起，‘荷蘭西峽’‘荷蘭草莓’聚在一起。在遺傳相似系數(shù)為0.74處可把供試品種劃分為4個主要類群。第I類有7個品種，歐美3個、我國3個和日本1個；第II類有17個品種，以歐美品種為主(12個)，還包括廣泛用作育種親本的日本‘紅顏’草莓以及我國培育的‘京怡香’草莓，‘紅顏’是‘京怡香’的親本之一；第Ⅲ類包括11個品種，其中歐美品種有6個，‘紅富美’‘紅珍珠’‘加拿大四季’聚在一起，歐美品種‘西5’‘賀登’和日本品種‘宮本7號’聚在一起，推測這些草莓可能具有較近的親緣關(guān)系；第Ⅳ類共49個品種，其中歐美品種17個，我國品種22個，日本和韓國品種共10個，包括市場主栽草莓品種‘甜查理’‘紅袖添香’‘妙七’‘香野’等。我國地方品種‘丹東大果’‘石頭河子’與我國選育品種遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖中序號對應(yīng)的草莓品種詳見表1。I～I(xiàn)V表示在遺傳相似系數(shù)0.74處84個草莓品種所聚類成的4個類群。 SeeTable 1 for the detailed strawberry information corresponding to the code number in theFig.2. I～I(xiàn)V represents 4 groups of 84 strawberry samples clustered at genetic similarity coefficient 0.74. 圖2 基于18對SSR標(biāo)記的84個草莓品種聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of 84 strawberry based on 18 SSR markers

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過不同渠道引進(jìn)國外草莓資源以及各地頻繁引種，導(dǎo)致我國草莓名稱容易出現(xiàn)同物異名或同名異物等現(xiàn)象。如本研究中的草莓品種‘都卡’疑似為荷蘭品種‘因都卡’(Induka)，草莓品種‘紅崗特利德’(Red gauntled)有研究稱為‘紅崗利特德’[21]或稱為‘紅手套’[8]。因此，對于國外引進(jìn)品種有必要規(guī)范品種名稱，建議從國外引進(jìn)的品種可直接記錄英文名稱，避免出現(xiàn)命名混亂的情況。另外，對于品種名稱不確定的資源，可以通過建立DNA指紋圖譜來區(qū)分不同品種。本研究構(gòu)建了84個草莓品種的DNA指紋信息數(shù)據(jù)庫，為這些草莓品種準(zhǔn)確區(qū)分提供了方法。

本研究所用的SSR引物選自苗立祥等[13]基于草莓基因組序列開發(fā)的，從中篩選出的18對引物多態(tài)性較好，對84個草莓品種擴(kuò)增條帶數(shù)和片段范圍與苗立祥等[13]報道的有些差異，其原因除了苗立祥等[13]引物直接標(biāo)記熒光而本研究使用M13熒光引物之外，還可能跟所用試驗材料不同有關(guān)。許多研究者應(yīng)用熒光SSR標(biāo)記的毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測的方法構(gòu)建了小麥[18]、高粱[19]和水稻[20]等作物的指紋圖譜，黃志城等[12]參照小麥指紋編碼方法，按照固定引物順序，串聯(lián)各帶型編碼，形成1組代表該品種的數(shù)字信息，構(gòu)建了中國草莓已知品種DNA指紋信息數(shù)據(jù)庫。本研究參考前人的方法對每對引物擴(kuò)增草莓樣品的帶型進(jìn)行編碼，但與前人研究的區(qū)別在于之前研究中帶型編碼以數(shù)字1～9和英文A～Z(記錄10以上的帶型)表示，所以指紋信息中每一位數(shù)字或字母代表每個引物的擴(kuò)增帶型信息，如第2位數(shù)字或字母代表第2個引物擴(kuò)增的帶型特征；而本研究中僅以數(shù)字記錄帶型，首次將引物進(jìn)行編號，引物編號與相應(yīng)的帶型編碼進(jìn)行組合得到該樣品在特定引物的擴(kuò)增產(chǎn)物編碼，按照18對引物順序串聯(lián)這些編碼形成該品種的DNA指紋圖譜。與前人指紋圖譜編碼方法相比，本研究采用的編碼加入引物編號，使編碼更方便，不易出錯。

本研究基于18對SSR引物建立了84份草莓品種資源的遺傳關(guān)系，品種間遺傳相似系數(shù)范圍為0.61～0.99，與韓柏明等[21]利用18對SSR引物研究96份草莓資源的相似系數(shù)在0.62～1.00的研究一致。說明現(xiàn)有草莓品種之間親緣關(guān)系較近，可能與常規(guī)雜交選育新品種的方式有關(guān)。本研究中聚類分析發(fā)現(xiàn)，我國選育的品種與國外品種混雜在一起，其可能原因是我國選育品種和地方品種及日本品種都直接或間接來源于歐美品種[21]，導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此今后我國草莓育種應(yīng)收集利用更多種質(zhì)資源，尤其是野生資源，拓寬草莓品種遺傳基礎(chǔ)，為培育出優(yōu)質(zhì)的草莓新品種奠定基礎(chǔ)。