‘隴薯8號’馬鈴薯塊莖淀粉積累特性及淀粉-蔗糖代謝途徑轉錄組分析

賈小霞 李建武 齊恩芳 文國宏 李高峰 呂和平 馬 勝 劉 石 黃 偉 張 榮

(1.甘肅省農業科學院 馬鈴薯研究所/甘肅省馬鈴薯種質資源創新工程實驗室，蘭州 730070； 2.國家種質資源渭源觀測實驗站，甘肅 渭源 748201)

淀粉是人類最重要的膳食能量來源，占每日熱量攝入總量的80%，因此在食品工業中起著至關重要的作用[1-3]，同時也是許多工業應用的原料，全球每年工業對淀粉的需求量為1.8億t[4]。與其他谷類作物淀粉粒相比，馬鈴薯淀粉粒較大，且高度磷酸化，這不僅增加了淀粉溶液的粘度，且賦予了其微弱陰離子、高膨脹力和糊化溫度低等特性[5]，被廣泛應用于食品、醫藥、紡織、造紙、化學等各個領域[6]。淀粉作為馬鈴薯塊莖中重要的儲能物質，占塊莖鮮重的10%～25%，占塊莖干物質的60%～80%[7]，很大程度上影響著馬鈴薯鮮食和加工品質的優劣，因此，選育高淀粉馬鈴薯新品種具有重要意義。甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所選育的中晚熟馬鈴薯新品種‘隴薯8號’平均淀粉含量穩定在22.91 g/100 g以上，超過了國內高淀粉品種標準18 g/100 g，屬超高淀粉型[6,8]，分析其淀粉積累規律及其淀粉合成代謝相關基因的表達模式，了解其淀粉合成特點，可為馬鈴薯淀粉相關基因的鑒定、功能分析以及高淀粉含量的新品種選育提供參考。淀粉的合成受蔗糖合酶(Sucrose synthase，Susy)、UGP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)、磷酸葡萄糖變位酶(Phosphoglucomutase，PGM)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophsphorylase，AGPase)和淀粉合酶(Starch synthase，SS)等多種酶的協同催化[9]，受編碼多種酶基因表達的影響[10-11]。關于馬鈴薯塊莖淀粉合成相關基因的研究多集中在通過抑制[12-13]或過量表達[14-15]方式干預淀粉含量及其組分的合成以及部分關鍵基因在不同品種中的表達分析等方面[16]。馬鈴薯栽培種是高度雜合的同源四倍體，遺傳背景十分復雜，借助分子生物學方法逐一地研究淀粉合成代謝相關的大量基因，難度大、效率低。高通量轉錄組測序(RNA-Seq)技術能夠全面快速獲取特定器官或組織在特定狀態下的幾乎所有轉錄本[17]，可系統分析馬鈴薯塊莖在不同生長發育時期的基因調控網絡。石瑛等[18]應用RNA-Seq技術研究了‘東農310’馬鈴薯塊莖不同發育時期的基因轉錄情況，并對各時期表達差異顯著的基因進行了功能注釋。目前，結合淀粉積累規律高通量分析馬鈴薯淀粉合成代謝相關基因表達模式的研究鮮見報道。因此，本研究通過對超高淀粉馬鈴薯品種 ‘隴薯8號’不同發育時期的塊莖進行蔗糖和淀粉含量測定以及RNA-Seq，旨在分析‘隴薯8號’淀粉積累規律及其淀粉合成代謝相關基因的表達模式，以期為馬鈴薯淀粉合成相關基因的鑒定、功能分析以及‘隴薯8號’在馬鈴薯育種研究中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種‘隴薯8號’和‘隴薯13號’由甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所提供。試驗用原種于2020年4月中旬種植于渭源縣會川鎮甘肅省農業科學院馬鈴薯育種基地(35°03′ N，104°04′ E，海拔2 240 m，年平均氣溫5.7 ℃，降雨量560 mm，無霜期130 d左右)，露地平播種植，按照常規管理方式進行田間管理。對同時處于盛花期的植株進行標記并采樣，樣本記為T1，之后每15 d采一次樣，共采5次，分別記為T2、T3、T4和T5。每個時期分別采集塊莖樣本，設3次生物學重復，每個重復選3株長勢一致的植株，每株取2個塊莖，每個塊莖分別取其頂部、中部、底部3片厚度為0.5 cm的薄片，然后切成均勻一致的小顆粒，等重量充分混合，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 淀粉含量測定

將‘隴薯8號’塊莖樣本在冷凍干燥機(ALPHA1-2LD plus)冷凍干燥后，在研缽中研磨成細粉，用30目篩子過濾后，使用分光光度計(UV-2102C)，利用夢犀生物醫藥科技有限公司生產的植物淀粉測定試劑盒，通過雙波長光譜測定淀粉含量，每個發育階段3個生物學重復。

1.3 蔗糖含量測定

利用夢犀生物醫藥科技有限公司生產的蔗糖含量測定試劑盒，按照試劑盒說明書測定‘隴薯8號’塊莖蔗糖含量。

1.4 轉錄組測序

采集‘隴薯8號’T1、T2、T3、T4和T5的塊莖樣本，每時期設3個生物學重復，分別記為T1-1、T1-2、T1-3，T2-1、T2-2、T2-3，T3-1、T3-2、T3-3，T4-1、T4-2、T4-3，T5-1、T5-2、T5-3，按1.1的方法取樣后，委托北京百邁客生物信息科技有限公司借助Illumina HiSeq Xten平臺進行高通量轉錄組測序。

1.5 差異表達基因的篩選、功能注釋和富集分析

測序得到的原始數據(Raw data)，過濾掉含有接頭和低質量的數據后，得到Clean reads，將Clean data與馬鈴薯參考基因組(http:∥solanaceae.plantbiology.msu.edu/dm_v6_1_download.shtml)進行比對。根據FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值法計算每個基因在5個時期15個樣本中的表達量，利用DESeq2_EBSeq軟件進行分析，找出不同樣本之間差異表達的基因(FDR<0.01且|Fold Change|≥2)，將Unigene在相應的數據庫(Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG)中進行序列比對，獲得注釋信息。分別利用topGO[19]和KOBAS[20]軟件對差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)進行富集分析。

1.6 qRT-PCR分析

為驗證RNA-Seq結果的可靠性，從DEG中隨機選取4個基因(Soltu.DM.01G049590、Soltu.DM.07G001730、Soltu.DM.08G001120和Soltu.DM.02G027020)，以馬鈴薯EF1α基因為內參，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法分別檢測各基因在‘隴薯8號’T1、T2、T3、T4和T5中的表達量。為驗證Soltu.DM.09G031820、Soltu.DM.07G013370、Soltu.DM.01G049590和Soltu.DM.02G027020在淀粉含量不同的馬鈴薯品種中的表達水平，選擇中晚熟(生育期120 d左右)低淀粉含量(16.27 g/100 g)品種‘隴薯13號’[21]T2和T5時期塊莖樣本和‘隴薯8號’相應時期的塊莖樣本，提取總RNA并進行反轉錄，以轉錄的cDNA為模板，根據目標基因序列設計特異性引物(表1)，按照 SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)反應體系，用ABIPRISMR 7300 實時熒光定量PCR儀(ABI，USA)進行qRT-PCR擴增，反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環。采用2-ΔΔCT法計算各目的基因的相對表達量[22]。

1.7 統計分析

原始數據用Microsoft Excel 2010 軟件整理后，運用DPS V3.01軟件進行單因素方差(One-way analysis, ANOVA)統計分析，所有數據均為“各重復的平均值±標準誤”。

2 結果與分析

2.1 塊莖發育過程中蔗糖和淀粉動態變化規律

由圖1可知，在整個取樣期內，蔗糖含量在T1—T3顯著降低，T3達到最小值;T3—T4有所回升，且T4顯著高于T3;T4—T5略有降低，但二者差異不顯著。淀粉含量隨生育進程的推進逐漸增加，其中T1—T3顯著增加，且T2—T3為激劇增長期，T3—T5持續增加，但各時期差異不顯著。

2.2 測序質量評估和差異基因篩選

15個馬鈴薯樣本經建庫和測序，樣本的有效讀段數介于39 753 860—84 087 718，單一匹配率均在75% 以上，Q30也都在92%以上，說明RNA-Seq數據質量較好，測序數據可靠度高(表2)。

對15個轉錄組樣本數據進行參考基因組比對分析，共獲得14 634個基因的轉錄表達數據，經篩選得到各相鄰時期的差異表達基因(圖2)。T1vs T2差異表達基因總數為1 279，其中535上調，744下調；T2vs T3差異表達基因總數為427，其中224上調，203下調；T3vs T4差異表達基因總數為184，其中132上調，52下調；T4vs T5差異表達基因總數為300，其中157上調，143下調。

表1 用于qRT-PCR分析的基因及其引物Table 1 Genes and primers for analysis of qRT-PCR

T1、T2、T3、T4和T5代表從盛花期開始，每隔15 d取樣1次，共5次。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。 T1, T2, T3, T4 and T5 represent the five samples collected from the full flowering stage, and the samples were collected every 15 d. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same below.圖1 塊莖發育過程中蔗糖(a)和淀粉(b)含量動態變化Fig.1 Dynamic changes of sucrose (a) and starch (b) contents during tuber development

表2 RNA-seq數據總覽Table 2 Overview of RNA-seq data

紅、綠、黑色點分別代表顯著上、下調和表達量未發生變化的基因。 The red, green and black dots in theFigure represent significantly up-regulated, down-regulated and unchanged genes, respectively.圖2 差異表達基因火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed genes

2.3 淀粉-蔗糖代謝途徑差異表達基因篩選

由表3可知，T1vs T2差異表達基因最多，共16個(圖3)，其次是T2vs T3和T3vs T4，分別為8和6個，T4vs T5最少，只有4個。各相鄰時期的特有差異基因和各組間共有差異基因的總數為24個，其中4個注釋為蔗糖合酶(Sucrose synthase，EC:2.4.1.13)，3個注釋為葡聚糖內切1,3-β-葡萄糖苷酶(Glucan endo-1,3-beta-glucosidase，EC:3.2.1.39)，注釋為腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucose pyrophosphorylase，EC:2.7.7.27)、β-淀粉酶(beta-amylase，EC:3.2.1.2)、海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶(trehalose 6-phosphate synthase/phosphatase，EC:2.4.1.15 3.1.3.12)和胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 1/3，EC:3.1.4.1 3.6.1.9)各2個，注釋為淀粉合酶(starch synthase，EC:2.4.1.21)、葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶(glucan 1,3-beta-glucosidase，EC:3.2.1.58)、β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，EC:3.2.1.21)、內切葡聚糖酶(endoglucanase，EC:3.2.1.4)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，EC:2.4.1.1)、果糖激酶(fructokinase，EC:2.7.1.4)、海藻糖6-磷酸磷酸酶(trehalose 6-phosphate phosphatase，EC:3.1.3.12)、6-磷酸葡萄糖異構酶(glucose-6-phosphate isomerase，EC:5.3.1.9)和β-呋喃果糖苷酶(beta-fructofuranosidase，EC:3.2.1.26)各1個。

表3 各對照組差異表達基因注釋信息和log2(fold change)值Table 3 Annotation information and log2 (fold change) value of differentially expressed genes in each comparison group

紅色和綠色框分別代表上、下調差異表達基因；3.2.1.39：葡聚糖內切1,3-β-葡萄糖苷酶；3.2.1.58：葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶；3.2.1.21：β-葡萄糖苷酶；3.2.1.4：內切葡聚糖酶；5.3.1.9：6-磷酸葡萄糖異構酶；2.4.1.13：蔗糖合酶；3.6.1.9：胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員；2.7.7.27：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；2.4.1.21：淀粉合酶；2.4.1.15：海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶；3.1.3.12：海藻糖6-磷酸磷酸酶；3.2.1.2：β-淀粉酶。 The red and green boxes respectively represent up and down-regulated differentially expressed genes; 3.2.1.39: Glucan endo-1,3-beta-glucosidase; 3.2.1.58: Glucan 1,3-beta-glucosidase; 3.2.1.21: Beta-glucosidase; 3.2.1.4: Endoglucanase；5.3.1.9: Glucose-6-phosphate isomerase; 2.4.1.13: Sucrose synthase; 3.6.1.9: Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 1/3; 2.7.7.27: ADP-Glucose pyrophosphorylase; 2.4.1.21: Starch synthase; 2.4.1.15: Trehalose 6-phosphate synthase/phosphatase; 3.1.3.12: Trehalose 6-phosphate phosphatase; 3.2.1.2: Beta-amylase.圖3 淀粉-蔗糖代謝途徑(T1 vs T2)Fig.3 Starch-sucrose metabolic pathway (T1 vs T2)

2.4 淀粉-蔗糖代謝途徑差異基因表達分析

由表4可知，蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Soltu.DM.01G049590、淀粉合酶基因Soltu.DM.02G027020和糖原磷酸化酶基因Soltu.DM.03G007710在各時期表達量不盡相同，且除Soltu.DM.09G031820在T1的表達水平低于Soltu.DM.09G021500外,這5個基因在各時期的表達量均高于同期其他基因。

2.5 qRT-PCR驗證

分別對Soltu.DM.08G001120、Soltu.DM.07G001730、Soltu.DM.02G027020和Soltu.DM.01G049590基因在5個樣本中的表達量進行qRT-PCR驗證，并與RNA-seq數據以T1vs T2、T2vs T3、T3vs T4、T4vs T5進行比較分析。如圖4所示，2種方法分析后各基因的相對表達量雖不完全相同，但表達變化趨勢一致，說明RNA-seq測序數據具有較高的可重復性和準確性。

2.6 不同淀粉含量馬鈴薯品種中基因表達分析

由圖5可以看出，Soltu.DM.02G027020、Soltu.DM.07G013370、Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.01G049590四個基因在T2和T5時期的‘隴薯8號’塊莖中的表達量都高于‘隴薯13號’，其中除Soltu.DM.02G027020和Soltu.DM.09G031820基因分別在T2和T5時期的表達量在兩品種間差異不顯著外，各基因在其余時期的差異都達到顯著水平。

表4 不同基因在不同時期塊莖中的FPKMTable 4 FPKM value of different genes in different periods potato tubers

3 討 論

淀粉作為馬鈴薯塊莖最主要的碳水化合物，主要由蔗糖轉化而成，其合成和積累涉及復雜的生理生化過程，需要多種酶協同催化[23]，受編碼多種酶基因表達的影響[10-11]。‘隴薯8號’塊莖淀粉含量隨發育進程的推進逐漸增加，且前期淀粉積累速率遠超后期；蔗糖含量與淀粉含量的變化趨勢剛好相反(圖1)；4個相鄰時期比較組T1vs T2、T2vs T3、T3vs T4和T4vs T5的差異表達基因總數逐漸減少，總體上反映了‘隴薯8號’塊莖發育前期在分子功能、細胞代謝和生物過程等方面都比較活躍。

糖轉運蛋白(Sugar transporters，STs)在植物生長發育過程中發揮著重要作用，主要介導糖類物質的運轉，參與源和庫組織之間的碳水化合物的裝載和卸出[24-25]。蔗糖合成淀粉的過程發生在造粉體中，葉片中由光合作用合成的蔗糖通過韌皮部轉移至胞質中，然后在相關酶的作用下合成淀粉[26]，淀粉合成相關酶基因表達量的提高可能促進了造粉體中微管結構的增加，從而促進了造粉體中淀粉粒的形成與積累，最終提高了成熟籽粒中的淀粉含量[27]。本研究篩選出各時期差異表達的糖轉運蛋白基因3個(Soltu.DM.01G039610、Soltu.DM.04G035490和Soltu.DM.01G023330)，其中只有Soltu.DM.04G035490在整個取樣期高水平表達，其他2個基因表達量很低，推測Soltu.DM.04G035490在蔗糖的運輸中發揮重要作用。淀粉-蔗糖代謝途徑的上調表達基因數目和差異倍數在各相鄰時期的比較組間不盡相同，這意味著塊莖不同發育時期淀粉-蔗糖代謝途徑各基因的表達存在差異，可能正是因為這種差異才促成馬鈴薯塊莖的形態建成和淀粉的合成與積累。為了進一步掌握各基因的具體表達水平，對24個差異表達基因在5個時期的FPKM值進行了統計分析，發現雖然各基因在不同相鄰時期的表達量差異顯著，但除蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Soltu.DM.01G049590、淀粉合酶基因Soltu.DM.02G027020和糖原磷酸化酶基因Soltu.DM.03G007710在整個取樣期都高水平表達(FPKM較大)外，其他基因表達量極低。蔗糖合酶是植物蔗糖代謝途徑中非常重要的酶，它能可逆的催化UDPG+FructoseSucrose+UDP反應，既能催化蔗糖的合成，也能分解蔗糖，但通常認為它的主要作用是分解蔗糖[28]。蔗糖合酶也是蔗糖轉化為淀粉的關鍵酶，首先催化蔗糖轉化為尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，UDPG在UGP-葡萄糖焦磷酸化酶的作用下轉化成淀粉合成底物葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)[29-31]。本研究在整個取樣期內，2個蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370持續高水平表達，蔗糖含量顯著降低后有所回升，而淀粉含量持續增加，因此，推測Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370可能作為重要的調控基因，通過高水平表達調控蔗糖向淀粉的轉化過程，后期蔗糖含量有所回升，可能由蔗糖合成與分解之間的動態平衡導致。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是一種異形四聚體，馬鈴薯AGPase由2個大亞基(調節亞基)和2個小亞基(催化亞基)組成[32]，是淀粉生物合成途徑的主要調控位點和淀粉合成過程中的限速酶[33]，催化G-1-P轉變為淀粉合成的直接底物腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)[34-35]，ADPG中的葡萄糖基在淀粉合成酶的作用下轉移到α-1,4-葡萄糖的非還原性末端上，從而催化淀粉的合成。在馬鈴薯塊莖的淀粉合成過程中，AGPase主要在轉錄水平上對淀粉合成進行調控，其表達水平的高低對淀粉積累和組成具有決定性作用[36]。超量表達AGPase小亞基基因sAGP，AGPase酶活性增強、淀粉含量升高，抑制表達sAGP，則AGPase酶活性下降、淀粉含量降低[14]。

圖4 RNA-Seq數據的qRT-PCR驗證Fig.4 Validation of RNA-Seq data by qRT-PCR

圖5 不同淀粉含量馬鈴薯品種中4個淀粉-蔗糖代謝途徑基因表達分析Fig.5 Expression analysis of 4 genes in starch-sucrose metabolic pathway of 2 potato varieties with different starch content

4 結 論

‘隴薯8號’塊莖淀粉含量在整個取樣期隨發育進程的推進逐漸增加，且前期急劇積累，后期積累量增加趨于平緩；蔗糖含量與淀粉含量的變化趨勢剛好相反。蔗糖合酶基因Soltu.DM.09G031820和Soltu.DM.07G013370、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Soltu.DM.01G049590和淀粉合酶基因Soltu.DM.02G027020在‘隴薯8號’的整個取樣期均高水平表達，與淀粉含量的不斷增加相吻合，并且在低淀粉品種‘隴薯13號’中的表達水平相對較低。因此，推測Soltu.DM.09G031820、Soltu.DM.07G013370、Soltu.DM.01G049590和Soltu.DM.02G027020可能在‘隴薯8號’塊莖的淀粉合成與積累中起重要的調控作用。