植物對低溫脅迫的響應機制研究進展

權 威 薛文通 趙天瑤 劉海濤 康玉凡*

(1.中國農業大學 農學院，北京 100193； 2.中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083； 3.北京方圓平安生物科技股份有限公司，北京 101127)

低溫作為一種常見的非生物逆境脅迫，影響植物的正常生長，并限制植物的地理分布[1]。全球氣候的變化導致極端低溫天氣時有發生，經常導致農作物產量下降，帶來很大的損失，制約了農業的發展[2-4]。為了減少低溫脅迫帶來的影響，植物進化出了一套復雜的抗寒機制來提高其抗寒性[5]，了解植物的抗寒機制對維持復雜氣候變化下的農作物生產有重要意義。分子生物學技術對這種復雜機制的研究已取得較大進展，鑒定出了很多參與低溫信號通路的轉錄因子、蛋白激酶和信號分子等重要組分[5]。

目前關于植物低溫脅迫響應機制方面的文獻綜述鮮有報道。本研究以“低溫脅迫”、“CBF”、“抗寒性”為關鍵詞，依據Web of Science核心合集、SpringerLink及中國知網等數據庫，檢索了2001—2022年已發表的相關文獻600多篇，系統分析了植物在低溫條件下的生理生化變化、植物低溫信號通路的研究報道，并依據已發表文獻繪制了擬南芥CBF低溫冷信號途徑調控網絡圖，探討了該領域尚未解決的問題，旨在了解植物對低溫脅迫響應機制的研究現狀，以期為進一步了解植物低溫響應機制提供參考。

1 低溫脅迫對植物生理生化的影響

低溫脅迫可以分為冷害(>0 ℃)和凍害(≤0 ℃)2種[5-7]。冷害脅迫通過改變植物的細胞膜結構、酶的活性、抗氧化能力等對植物的正常生長發育產生不利影響[8-9]，而凍害對植物的傷害與冷害存在較大差異，0 ℃以下的低溫會使植物細胞內與細胞間的水分結成冰晶，直接對細胞造成機械損傷[10]。植物在受到低溫脅迫時，會對其生物膜系統[11]、細胞滲透調節物質[12]、抗氧化系統造成一定影響[9]。

1.1 低溫脅迫對生物膜系統的影響

已有研究表明，細胞膜上存在可以感知冷信號的跨膜蛋白COLD 1(chilling-tolerance divergence 1)[11,13]，而冷脅迫還可以改變細胞膜的結構，讓膜脂狀態發生改變，增加膜透性，電解質滲透率也隨之增大，使細胞膜受損，這個過程還會導致蛋白變性，對膜定位蛋白的功能產生影響[14-15]。這些變化會因溫度下降幅度的加大而加劇，且低溫抗性越強的植物膜脂發生相變的溫度越低，變化程度越小，恢復能力也越強[16]。而相變溫度與膜的不飽和脂肪酸含量有關[6]，其含量的上升會導致膜流動性的加強，穩定性也得到增加，從而使質膜發生相變的溫度降低。0 ℃以下的低溫脅迫(凍害)會導致細胞大量失水，冰點降低，造成細胞嚴重脫水，當溫度快速回升時，細胞會大量吸水，過大的張力會形成 “細胞誘導型裂解”，使細胞膜嚴重受損[17-18]。所以，增加細胞膜穩定性是增強植株對低溫逆境抗性的關鍵[19]。

1.2 低溫脅迫對細胞滲透調節物質的影響

植物細胞內存在參與滲透調節的物質，這些物質在植物處于寒冷環境時不僅可以有效地維持細胞滲透壓，還能起到降低冰點的作用，從而提升植株低溫抗性[12]。

脯氨酸親水，呈中性，常以游離態的形式存在于植物細胞內，是一種重要的滲透調節物質[20]。它不僅可以調節滲透壓，還可以維持蛋白結構的穩定[21]。正常情況下，植物細胞中游離脯氨酸的含量處于一個比較低的水平，但當植物處于脅迫狀態時，其含量會迅速提升。植物的低溫抗性與寒冷條件下積累的游離脯氨酸的含量呈正比[22-23]，因此，植物體內的游離脯氨酸含量是評價其抗寒性的指標[24]。

可溶性糖和可溶性蛋白也是植物體內重要的滲透調節物質[25]。低溫環境下植物體內可溶性糖與可溶性蛋白的含量一般與植物的低溫抗性呈正相關[26-32]。甜菜堿含量也可以用來衡量植物抗寒性，其不僅可以促進種子萌發[29]，提高植物低溫抗性，還可以維持脂肪和蛋白質結構的相對穩定[30]，使植株抗氧化能力得到提升[31]。

1.3 低溫脅迫對植物抗氧化系統的影響

植物受到低溫脅迫時，光合速率會下降，光合電子鏈傳遞也受到影響[21]，低溫結冰也會使細胞膜產生機械損傷，膜脂過氧化，使植物細胞內積累大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，這會使植物體內抗氧化酶的活性升高，而低溫又會降低抗氧化酶的活性，所以植物體內POD、SOD、CAT三種酶的活性一般會呈現先上升后下降的趨勢[9,32-34]。而低溫抗性較強的植物即使在溫度較低的情況下，抗氧化酶仍能保持一定活性來清除ROS，減輕ROS對植物造成的損傷[35]。

2 低溫脅迫對植物信號通路的影響

2.1 植物低溫信號感知

隨著對植物低溫脅迫響應機制研究的不斷深入，植物的低溫信號通路研究已經有了比較大的進展，但關于低溫感受器的研究迄今為止都沒有明確的結果[36-38]。Ma等[11]研究表明COLD 1是一個定位在內質網膜與細胞質膜上的低溫感受蛋白。在水稻中，COLD 1能和G蛋白(RGA 1)的α亞基發生相互作用，激活Ca2+信號通路，進而刺激下游冷信號轉導引起一系列生理生化反應來增加植物抗寒能力[39-40]。所以，Ca2+是應答植物低溫脅迫中非常重要的第二信使[41]。除了Ca2+，ROS也在低溫信號轉導通路起到關鍵作用[42]。植物在感受到低溫脅迫時，會伴隨著細胞內大量ROS的產生，ROS可以使細胞內氧化還原電位發生變化，且ROS含量還與Ca2+傳導密切相關[43-44]。但過量的ROS會導致細胞發生膜脂過氧化[45]，產生丙二醛(MDA)，這會進一步對膜造成傷害從而影響正常的生理功能[46]。除此之外，擬南芥在4 ℃條件下暴露1 h后就會被檢測到一氧化氮(NO)含量顯著上升，說明NO在植物響應冷刺激時也起到了信號轉導的作用[47-48]。

2.2 低溫脅迫的信號調控網絡

Liu等[49]提出植物的低溫抗性是一個數量性狀，在擬南芥中約有4%～20%的基因會參與低溫應答機制，這些基因也被稱為冷響應基因(cold-responsive，COR)[50]。CBF(C-repeat binding factors)-COR途徑是目前報道最廣泛的途徑之一，在植物遭遇低溫脅迫時起重要作用，而對于CBF-COR不依賴途徑的報道則較少[44]。

2.2.1CBF低溫信號途徑和調控

CBF轉錄因子，也被稱為DREB 1(de-hydration-responsive element-binding factors 1)，含有AP 2/ERF(APETALA 2/ethylene-responsive)保守結構域。在擬南芥中共發現了4個CBF家族的基因，其中CBF1～CBF3在擬南芥4號染色體短臂上的8.7 kb區域以CBF1、CBF3、CBF2的順序排列[51-53]，CBF4基因則位于擬南芥基因組的第5號染色體上[54]。植物受到低溫脅迫時，CBFs會與COR基因中的CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)順式作用元件結合，并上調一些CORs的表達[55-57]。目前，研究者已經創制了擬南芥CBF 1～CBF 3的單突變體、雙突變體、三突變體和過表達CBFs的植株[58-61]，對多種植物中的CBF同源基因進行了鑒定克隆[37,57,62-63]，并將一些作物的CBFs基因在其他作物中進行異源表達[63-65]，以便更深入的了解CBF基因家族在植物受到低溫脅迫時的作用，結果表明CBF基因家族可以在很多植物中增強植物的低溫抗性。Park等[37]研究表明CBF在植物的正常發育中也非常關鍵，且在低溫脅迫時表現出功能冗余。除此之外，CBF家族基因之間的關系也非常復雜，且在擬南芥CBF突變體的研究中還發現了相互矛盾的結果[58,61]。Zhao等[58]研究發現擬南芥cbf2突變體對冷脅迫比野生型更加敏感，而Novillo等[61]研究結果則顯示CBF2的T-DNA插入突變會使植物的抗寒性得到提升。不同的植物中CBF的作用也存在差異[64]，Zhang等[64]研究發現番茄中的CBF1與CBF3過表達植株均未能對抗寒性產生影響，且將8個番茄中與擬南芥可以調節CBF基因表達的高度相似的基因在番茄植株進行過表達，都未影響其CBF基因的表達，這表明CBF的調控可能存在物種特異性，但不可否認的是，CBF基因家族對植物應答低溫是非常重要的[66-67]。

2.2.1.1CBF轉錄調控因子 目前，ICE 1(inducer of CBF expression 1)是研究較多的CBF關鍵轉錄激活因子[63]。ICE 1是一種bHLH(basic-helix-loop-helix)轉錄因子，可以與CBF1～CBF3啟動子的MYC結合位點特異性結合并上調CBFs的表達，使擬南芥植株的抗寒性得到提升[68]。但在擬南芥ICE1基因發生突變的個體中CBF1及CBF2的表達并沒有出現明顯變化，這表明ICE 1的調節功能可能與MYC結合位點數目有關[69]。不同作物的ICE 1序列相對保守，許多其他植物的ICE1基因都能在擬南芥中表達并增強植株的低溫抗性[70]。ICE2與ICE1同源，在過表達ICE2的擬南芥植株中，其低溫抗性也會得到顯著增強，而且CBF1的表達也會上調，說明ICE 2在擬南芥抵御低溫脅迫方面也發揮了積極作用[71]。ICE1在低溫環境中的表達也受到許多因素的調控，這與ICE 1翻譯后修飾有關，而一些轉錄抑制因子(MYB 15)也可以直接與ICE 1互作從而調節其轉錄活性[72]。有證據表明ICE 1/2還參與了擬南芥氣孔細胞的分化，雖然低溫脅迫也能使氣孔的運動受到影響，但ICE 1/2是否參與了低溫脅迫下氣孔運動的調節還不清楚[38]。

鈣調素結合轉錄激活因子(calmodulin-binding transcription ctivators，CAMTA)蛋白也是CBFs的轉錄激活因子[73]。它含有一個保守的鈣調素結合位點，這些位點可以通過與CBFs結合來調控CBFs基因表達[73]。不同的CAMTAs家族成員可以激活不同的CBFs，Doherty等[73]與Kim等[74]研究所發現的CAMTAs對CBFs的調控都是正向的，其中CAMTA 1與CAMTA 2可以調控CBF1/CBF2/CBF3的表達。一般情況下，CAMTA 3只參與CBF2的轉錄調控，但也有研究發現CAMTA 3與CAMTA 5在溫度迅速降低時也能影響CBF1的表達[73]。這些研究表明CAMTAs家族在對CBFs的調控存在功能冗余。

MYB類蛋白也參與了冷脅迫下CBFs的調控[75]。MYB類蛋白均具有保守的DNA結構域(DBD)，可以通過與CBFs啟動子區域MYB識別位點結合從而發揮調節CBFs表達的功能[76]。MYB 15在受到冷信號刺激時負調控CBFs的表達[75]，Kim等[77]研究發現MYB 15可以與MPK 6相互作用并磷酸化，使植物的抗寒性得到提升。除此之外，MYB15還能與ICE蛋白互作，從而解除MYB 15對CBFs的抑制作用[76]。水稻中的OST 1(open stomata 1)蛋白激酶可以通過磷酸化PUB 25/26來增強E3連接酶的活性，導致MYB 15發生泛素化降解，最終使植物的低溫抗性得到提升[78]。

2.2.1.2CBF低溫信號調控網絡 植物體內的低溫信號調控很多是通過對一些關鍵蛋白的翻譯后修飾來實現的，修飾的方式包括磷酸化[79]、泛素化[80]、類泛素化(sumoylation，SUMO)[81]以及豆蔻酰化[82](圖1)。擬南芥中的MPK 3/6(mitogen-activated protein kinases)可以被冷信號激活，與ICE 1蛋白互作使其磷酸化，這會使ICE穩定性下降并負向調控其表達，進而使植物的抗寒性下降[83]。當植物受到低溫脅迫時，COLD 1會與RGA 1形成復合物，打開Ca2+通道，使Ca2+內流，從而使Ca2+/鈣調素受體類激酶(calcium/calmodulin-regulated receptor-like kinases 1，CRLK 1)和CRLK 2被活化[83-84]。CRLK 1/2可以抑制MPK 3/6的活性，還可以激活MEKK 1-MKK 1/2-MPK 4級聯反應從而拮抗MAPKKK-MKK 4/5-MPK 3/6級聯反應來正向調控CBFs的表達[83]。而在水稻植株內發現的OsMPK 3蛋白可以通過磷酸化使OsICE 1的結構更加穩定，干擾OsHOS 1(high expression of osmotically responsive gene 1)介導的泛素化降解過程，增強植物的低溫抗性。這說明不同植物體中的MPK 3在植物低溫響應網絡中的作用存在很大差異[85]。細胞膜上還發現了一個類受體激酶CRPK 1(Cold-responsive protein kinases 1)，也參與了低溫響應下的CBFs的表達調控。CRPK 1可以被冷信號激活，使存在于細胞質里的14-3-3蛋白發生磷酸化，使其可以進入細胞核內并與CBF 1/3發生互作，進而促進CBFs的泛素化降解，導致植物的抗寒性降低[86]。

圖1 擬南芥中CBF低溫信號途徑調控網絡Fig.1 CBF regulatory network of Arabidopsis response to low temperature

OST 1/SnRK 2.6蛋白激酶是脫落酸核心信號通路的關鍵組件，也是第一個被發現的可以使ICE 1磷酸化的蛋白激酶[79]。擬南芥中的OST 1可以被冷信號激活，與ICE 1互作使其Ser278位點磷酸化，該磷酸化與MPK 3/6的磷酸化位點不同，可以使ICE 1更加穩定并阻止HOS 1介導的ICE 1泛素化降解過程，正向調控植物的抗寒性[79]。OST 1還可以磷酸化擬南芥中BTF 3(basic transcription factor 3)和BTF3L，BTF3 s經過磷酸化后可以使CBFs的表達量上升，干擾CBFs的泛素化從而避免其被分解，可使植物對低溫的抗性增強[80]。Ding等[82]研究發現OST 1的活性受到蛋白激酶EGR 2的調控。EGR 2在植物受到低溫脅迫時，會與N-肉豆蔻酰轉移酶(NMT1)互作，抑制EGR 2的豆蔻酰化從而阻礙豆蔻酰化的EGR 2與OST 1的結合，釋放出更多有活性的OST 1，增強植株低溫抗性。

擬南芥中的HOS 1是低溫信號途徑中的負調控因子[87]。HOS1的過表達可以抑制CBF3的表達[72]。HOS 1與ICE 1發生物理互作并使其泛素化，使ICE 1被降解，從而導致植物抗寒能力下降[72,88]。Johnson等[89]研究發現擬南芥細胞質中的BIN 2(BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2)可以通過磷酸化ICE 1促進其泛素化降解，但BIN酶的活性在冷應激反應的初期是受到抑制的，這有利于初期植物抗寒性的提升，而當CBF的表達量開始下降時，BIN 2活性會顯著增加，促進ICE 1的降解，這表明BIN 2可能參與了CBF表達的精細調控。類泛素化則可以阻礙泛素化來阻止靶蛋白的降解，而低溫會促進類泛素化結合物的累積[89]。SIZ 1(SAP and Miz 1)可以介導ICE 1在LYS393位點的類泛素化而使ICE 1蛋白變得更加穩定，阻礙HOS 1介導的ICE蛋白泛素化降解過程，使CBFs的表達量增加[90]。

Trx-h2是一類N-端第二個氨基酸位置上含有保守的Gly殘基且C-端含有NLS的氧化還原蛋白，其在低溫條件下也可以與CBFs特異性互作[91]。低溫脅迫會使植物產生大量ROS，ROS作為冷信號分子將低溫脅迫信號轉導到Trx-h2，因此，在冷介導CBF mRNA表達和CBF翻譯發生之前，電子從Trx-h2到CBF的快速轉移可以減少氧化CBF寡聚體的非活性形式，并將其蛋白結構轉換為有活性的還原態CBF單體，從而上調COR基因的表達，增強植株低溫抗性[91-93]。

2.2.2非CBF-COR依賴低溫信號途徑

Lee等[50]研究表明植物體內有70%以上的CORs的調控并不依賴CBFs轉錄因子(圖2)。將水稻中的Osmyb 4轉錄因子在擬南芥中過表達可以顯著提高轉基因植株的低溫抗性，這個過程并不依賴CBF通路的調控[94]。過表達MYBC1的擬南芥植株抗凍能力下降，但植株中的CBFs表達并沒有受到影響，說明MYBC 1可以通過不依賴CBF的途徑使植物的抗寒性降低[95]。Shi等[96]在擬南芥中發現一個核因子HAP5A(nuclear factor Y)，它能與水解酶XTH 21的啟動子結合增強植物的抗寒性，這個過程也不需要依賴CBF通路。此外，水稻中的MYB轉錄因子OsMYB3R-2、擬南芥HOS 9、HSFA 1等基因或轉錄因子都可以不依賴CBFs來調節植物的低溫抗性[97-99]。

圖2 擬南芥中依賴和不依賴CBF途徑中的正負調控因子[65]Fig.2 Positive and negative regulators in CBF-dependent/independent pathway in Arabidopsis[65]

3 展 望

低溫是許多農作物正常生長發育的限制因子，深入了解植物的低溫響應機制不僅有助于為耐低溫育種提供理論支持，而且能通過轉基因技術將一些作物中能顯著提高植物低溫抗性的基因導入其他作物進行異源表達來突破其種植地域的限制，提高植物低溫抗性。但一些生長在熱帶的冷敏感植物，可能積累了很多有利于在高溫環境生長的突變，使其可以在熱帶環境中更好的生長，而這些突變很可能會對植物低溫響應機制造成負面影響，使提高其低溫抗性變得更加的困難，因此，需要對植物的抗寒機制有更全面透徹的了解才能實現。

雖然CBF-COR應答途徑在植物受到冷脅迫時起著關鍵的作用，目前研究表明只有10%～25%的CORs受到CBFs的調控，也就是說，植物中的絕大多數CORs基因其實并不依賴CBFs調控[60,64]。目前已發現很多不依賴CBFs的基因和轉錄因子可以影響植物的低溫抗性，但關于這一部分的研究數據尚不能構建出基因調控的網絡。同時在CBF-COR依賴途徑中也還存在很多尚未明確的問題，例如，MPK 3/6導致ICE 1發生泛素化降解的過程，CBF調控CORs表達等[37]，這都需要進一步的研究。

植物低溫感受器與低溫信號傳導的相關研究也還存在很多待解決的問題。目前比較明確的植物低溫信號感受蛋白只有COLD 1，可以調節細胞質中Ca2+濃度，從而傳遞冷信號[11]，而其他低溫信號感受蛋白的報道比較少，這就導致目前了解到的很多低溫調控通路是不完整的[38]，例如CRPK 1與OST 1被冷信號激活參與CBF途徑的調控的過程等。目前認為Ca2+、ROS、NO都參與了低溫信號傳導[40,42-44]，它們如何參與信號轉導，是否還有其他的信號分子也參與了冷信號傳導等，將成為今后的研究重點。

植物對低溫脅迫響應的機制相當復雜，雖然很多植物中都發現了擬南芥應答低溫脅迫的同源基因，但這些基因的功能卻與擬南芥中的基因存在差異，這些差異會導致不同作物間低溫信號網絡存在差異。目前對低溫冷信號調控網絡的研究還主要集中在擬南芥，對其他作物的研究相對較少，但若想更全面深入的了解植物低溫脅迫的響應機制，還需要對更多植物進行更深入的研究。