組蛋白去乙酰化酶抑制劑對呼吸道合胞病毒感染誘發的氣道炎性反應作用機制

馮秋琴，黃 歡，楊 眉，田 曼

(1.珠海市婦幼保健院，廣東 珠海 519000；2.南京市兒童醫院呼吸內科 南京 醫科大學，江蘇 南京 210008)

呼吸道合胞病毒(RSV)是毛細支氣管炎和肺炎的主要原因，除了直接損傷上皮細胞，RSV病毒感染患兒和免疫缺陷患者通常會有嚴重的呼吸道炎性反應[1]，包括促炎因子分泌、支氣管和血管中炎性反應細胞增加和黏液生成。針對RSV感染，診斷干預措施對臨床結局的影響不大，除了支持措施，如氧療、對癥支持外，國內外還沒有具體的藥物治療方法。因此，毛細支氣管炎是一個臨床難題，是臨床及研究人員面臨的重大挑戰。

蛋白質乙酰化是一種重要的表觀遺傳修飾模式，在宿主防御病毒感染中起著關鍵作用。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是從組蛋白上的特定賴氨酸殘基去除乙酰基部分以調節染色質結構和基因表達的酶，通過調節蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質-DNA相互作用的變化，起到控制不同的細胞功能的作用[2]。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)被證實在很多疾病中有抑制疾病發展的作用，HDACi起初因作為抗癌藥物的潛在用途而受到關注，研究發現HDACi類藥物曲古抑菌素A(TSA)對對乳腺癌細胞株增殖周期起到抑制作用[3-4]。TSA可能是調節呼吸道RSV誘導的毛細支氣管炎的一種新的治療方法，為臨床新治療手段提供基礎研究依據。除具有抗癌活性外，HDAC抑制劑被發現還具有有效的抗炎特性，如TSA可以抑制甲肝病毒的復制從而降低丙肝感染風險[5]，其治療效果還在膿毒性休克、類風濕關節炎、多發性硬化和哮喘等炎性疾病中得到證實[6-8]。而HDACi在調節呼吸道疾病中的研究除了哮喘以外其余疾病研究很少。

本研究經過本院醫學倫理委員會同意，旨在從細胞水平探索HDACi代表藥物TSA在RSV復制中的功能，并確定TSA對RSV病毒炎性反應的影響及對氧化應激的影響。

1 資料與方法

1.1實驗材料：化學品和材料：人支氣管上皮細胞系BEAS-2B購自American Type Culture Collection(ATCC；Rockville，MD，USA)；藥品TSA、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)購自St.Louis，MO，USA；細胞DMEM培養基和胎牛血清購自Carlsbad，CA，USA；白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自Shanghai Ex Cell Biology Inc(中國上海)；丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)ELISA試劑盒購自 Jiancheng Bioengineering Institute(中國南京)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養、RSV病毒處理和藥物毒力檢測：人支氣管上皮細胞系BEAS-2B在補充有胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養基中進行培養[9]。根據實驗設計，將BEAS-2B細胞以適當的密度鋪板用于體外細胞實驗，并在實驗前細胞生長36 h，后使用各種劑量[感染復數(MOI= 5、1、0.5、0.1、0.01)]RSV進行感染處理，再將指定濃度的TSA加入培養的BEAS-2B中，以確定TSA對細胞活力的影響，進行細胞活力測定的目的是確定藥物TSA對培養的氣道上皮細胞的潛在毒性作用。可見用500 nmol/L TSA處理BEAS-2B細胞不影響細胞生長活力，表明TSA抗病毒作用不是由于細胞毒性作用。

1.2.2Western印跡檢測RSV作用后的BEASE-2B細胞HDAC2水平變化：體外培養人支氣管上皮細胞系BEAS-2B細胞，在實驗前細胞生長36 h，本次實驗設計為對照組和不同劑量RSV處理組，用不同劑量的RSV(MOI=5、1、0.5、0.1、0.01)感染BEAS-2B細胞，并通過蛋白質印跡分析評估各組HDAC2的表達水平。

1.2.3Western印跡檢測TSA作用RSV感染后的BEASE-2B細胞乙酰化組蛋白(Ac-H3)水平變化：體外培養人支氣管上皮細胞系BEAS-2B，在實驗前細胞生長36 h，本次實驗設計為對照組、TSA處理組、RSV處理組、藥物TSA+RSV病毒處理組，首先運用Western印跡檢測不同劑量RSV病毒高劑量[(MOI=1)或低劑量(MOI= 0.1)]對細胞乙酰化組蛋白表達的影響，后用TSA處理RSV感染的BEAS-2B細胞[高劑量(MOI=1)或低劑量(MOI=0.1)]，24 h后運用蛋白印跡方法檢測藥物TSA加入后對RSV感染誘導的Ac-H3的表達水平。

1.2.4聚合酶鏈反應(q-PCR)技術檢測HDACi兩種代表藥物TSA/SAHA對RSV病毒復制的影響：體外培養BEASE-2B細胞，將BEAS-2B細胞與500 nmol/L TSA或SAHA預孵育，RSV濃度MOI設置為0.5，處理24 h，通過q-PCR技術方法測定RSV病毒復制水平。

1.2.5ELISA檢測炎性因子、氧化應激因子水平：體外培養人支氣管上皮細胞系BEAS-2B，在實驗前細胞生長36 h，用500 nmol/L TSA處理BEAS-2B細胞，并用各種劑量的RSV(MOI = 0.1或1)感染BEAS-2B，在感染后24 h收獲細胞上清液，通過ELISA測量IL-6和IL-8的產生。同時使用特定試劑盒測量氧化應激相關分子(MDA與NO)釋放。

2 結果

2.1RSV感染通過影響HDAC2表達改變組蛋白乙酰化水平:RSV感染的BEAS-2B細胞以MOI依賴性方式導致HDAC2的表達增加(見圖1)。為了分析RSV感染誘導異常HDAC2表達是否是直接改變的組蛋白乙酰化過程，將TSA用于RSV感染的氣道上皮細胞(AEC)，結果顯示，用500 nmol/L TSA處理RSV感染的氣道上皮細胞導致HDAC2表達顯著降低，其與組蛋白H3乙酰化水平呈反相關關系(見圖2)。該結果表明RSV誘導的氣道上皮細胞中的組蛋白乙酰化異常是通過改變HDAC2的表達，并且這種作用被去乙酰化酶抑制劑TSA逆轉。

圖1 RSV感染通過影響HDAC2表達改變組蛋白乙酰化水平

圖2 TSA處理RSV感染的BEAS-2B細胞測定Ac-H3表達

2.2HDACi可抑制RSV復制:實驗結果顯示，用TSA及SAHA處理RSV感染的BEAS-2B細胞病毒復制水平分別為(3.62±1.22)PFO/ml和(3.40±1.03)PFO/ml，較未干預BEAS-2B細胞病毒復制水平[(4.65±1.02)PFO/ml]明顯降低，表明均可顯著抑制RSV感染，表明HDACi可抑制RSV復制。

2.3用HDACi處理BEAS-2B細胞降低RSV誘導的炎性細胞因子釋放和氧化應激水平:RSV感染氣道上皮細胞24 h后IL-6和IL-8釋放增加，而運用TSA預處理的組BEAS-2B細胞的細胞培養物上清液中的IL-6和IL-8產生明顯減少(見表1)。另外，結果顯示RSV感染會誘導氧化應激分子NO和MDA的釋放，用HDACi類藥物TSA處理減輕這一損傷(見表2)。表明TSA可以抑制RSV誘導的氣道上皮細胞中炎性細胞因子的釋放和氧化應激損傷。

表1 ELISA測量IL-6、IL-8釋放水平

表2 測定氧化應激相關分子(MDA、NO)水平

3 討論

盡管進行了深入研究，RSV感染的病理機制仍不清楚。其中一個關鍵點是RSV感染后出現不同臨床癥狀的個體，有些人只有輕微的上呼吸道感染癥狀，不需要特殊治療，而在另一些人中，RSV感染可能導致更嚴重的疾病，包括毛細支氣管炎或肺炎，這些疾病可能致命，需要住院治療[10]。

HDAC在基因表達調控中起著至關重要的作用，因為它通過乙酰化和去乙酰化組蛋白來調節染色質結構，作為組蛋白乙酰化的主要調節劑，HDAC是轉錄和表觀遺傳調節的關鍵因子，之前研究證實組蛋白乙酰化控制某些病毒感染[11]。在感染人類的諸多病原體中，HDAC與病毒復制和發病有關，包括皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、柯薩奇病毒、乙型肝炎、丙肝病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒HIV-1[12]。如在HCV感染期間，HDACi SAHA通過改變宿主細胞中基因(如OPN和Apo-A1)的表達而對HCV復制發揮抑制作用。在本研究中，目的是確定組蛋白乙酰化是否在RSV復制和病毒誘導的氣道炎性反應的調節中起作用。

研究發現HDAC2對于肺部氣道炎性反應的發展起著至關重要的作用。HDAC2的異常表達介導了哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)患者甾體抗性作用[13]。鑒于嚴重的RSV感染誘發的毛細支氣管炎、哮喘和COPD存在密切關系，本文首先分析RSV感染對HDAC2表達的影響，證明了RSV引起HDAC2表達增加，并且RSV感染后組蛋白H3乙酰化被下調，用TSA治療RSV感染的氣道上皮細胞完全逆轉了這些作用。同時，研究發現氣道上皮細胞AEC暴露于TSA預處理后，觀察到RSV病毒復制明顯減少。總之，這些發現表明RSV對HDAC2表達的上調可能是促進病毒復制的重要機制，而組蛋白乙酰化的增強水平可以抑制病毒復制。

HDAC抑制劑在體外和體內研究發現具有發揮抗炎的作用。本研究發現使用TSA或SAHA可顯著減輕RSV誘導的促炎細胞因子的產生，包括IL-6和IL-8。另外，氧化應激相關因子可能由氣道上皮細胞AEC和氣道內皮細胞產生，參與多種形式的組織損傷，包括對脂質、蛋白質和DNA等細胞成分的損害[14]。有研究發現，RSV感染可以誘導AEC活性氧(ROS)的產生[15]，抗氧化酶的表達和活性降低可能有助于減輕這種損傷。在本研究中，RSV感染的AEC中NO、MDA產生明顯增加，說明抑制氧化應激作用也是HDACi類藥物在RSV感染過程中發揮的作用機制之一。

從本研究中可進一步從細胞實驗延伸到動物實驗甚至是臨床患者相關實驗，進一步明確和驗證去乙酰化酶抑制劑HDACi在RSV誘導的氣道炎性反應中的作用機制，為HDACi類藥物將來進入臨床治療呼吸道疾病提供重要的基礎實驗依據。