嗜酸乳桿菌LA-Y26高密度培養工藝條件優化

◆作者：譚文俊，張文，歐豪，潘杰華，向健

◆單位：清遠一生自然生物研究院有限公司

嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus）屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，是一種重要的益生菌，其形態多數呈現細長桿狀，分布較雜亂，以單個、成雙或短鏈出現，菌落邊緣較粗糙且不規則，通常呈中間向兩邊放線狀分布，顏色較透明。嗜酸乳桿菌具有改善腸道健康、調節免疫、減輕肥胖、治療腸道疾病等眾多益生功能。眾多試驗研究證明了嗜酸乳桿菌對治療腹瀉和縮短腹瀉時間有一定的功效，能夠很好地定殖于動物腸道，有效抑制致病菌的生長，調節宿主的菌群平衡。在其生長過程中會產生對病原菌和腐敗菌有一定的拮抗作用的代謝產物，能夠有效地抑制體內有害微生物的生長和繁殖以及毒素的分泌，起到平衡宿主腸道微生物菌群的作用，從而治療由致病菌引起的腹瀉。嗜酸乳桿菌在食品、藥品及飼料添加劑中均有應用，市場需求巨大。

本研究通過單因素實驗及正交試驗對嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵培養基和培養條件進行優化，為嗜酸乳桿菌LA-Y26高密度培養及工業化生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種、試劑和設備

1.1.1 菌種和試劑

菌種：嗜酸乳桿菌LA-Y26，分離自健康育肥豬腸道菌群，由本實驗室保藏；MRS培養基：按照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》方法配置；無水葡萄糖：廣州化學試劑廠；乳糖：阿拉丁試劑（上海）有限公司；甘露糖：阿拉丁試劑（上海）有限公司；麥芽糖漿：廣州雙橋股份有限公司；蔗糖：市售；蛋白胨；大豆蛋白胨；胰蛋白胨；牛肉浸粉；酵母提取粉均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 設備

電子天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1菌種活化

將嗜酸乳桿菌LA-Y26凍干管接入MRS液體培養基中，37.0℃培養20h，活化二代；

1.2.2 種子培養

將活化后的菌種按體積分數5.0%接種到裝有200mL MRS培養基的250mL三角瓶中，37.0℃培養20h。

1.2.3 嗜酸乳桿菌LA-Y26培養基優化

以MRS液體培養基為起始培養基，選擇添加量均為10.0g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖、甘露糖作為碳源，進行碳源優化試驗；選擇添加量均為10.0g/L的大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉作為氮源，進行氮源優化試驗；選擇添加量為1.0g/L的葉酸、生物素、維生素B1、天冬氨酸、賴氨酸進行促生長因子優化試驗。在三角瓶中進行試驗，37.0℃培養20h進行發酵液活菌計數，初步確定培養基成分。

在上述優化后的培養基基礎上，選擇最佳碳源、氮源、促生長因子進行正交試驗，得到最佳碳源、氮源、促生長因子的最佳添加量。

1.2.4 嗜酸乳桿菌LA-Y26三角瓶培養條件優化

在上述正交試驗基礎上，考察不同接種量、初始pH值、培養溫度、轉速及培養時間對嗜酸乳桿菌LA-Y26生長情況的影響，確定較優的三角瓶培養條件。

1.2.5 嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵罐驗證

在20L規模發酵罐進行小試試驗，將種子接種至裝有12L培養基的20L發酵罐中，按照1.2.4最優條件進行培養，取樣檢測活菌數，驗證優化后的培養基配方和培養條件。

2 結果和分析

2.1 嗜酸乳桿菌LA-Y26培養基優化結果

2.1.1 碳源優化結果

碳源是發酵培養基中主要的能量來源，充足的碳源有利于菌體的生長。由圖1可見，MRS培養基為對照，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖和甘露糖為碳源的培養基種，嗜酸乳桿菌活菌數量分別為2.7×108、4.1×108、3.8×108、3.6×108、4.9×108、3.2×108CFU/mL。以乳糖為碳源的培養基，嗜酸乳桿菌生長狀態明顯優于其他成分的培養基，葡萄糖、蔗糖次之。

圖1 不同碳源對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.1.2 氮源優化結果

氮源是構成生物體的蛋白質、核酸及其他氮素化合物的材料，用于菌體細胞物質和含氮代謝物的合成，充足且易于利用的氮源有利于細胞快速分裂。由圖2可見，MRS培養基為對照，以大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉為氮源的培養基中，嗜酸乳桿菌活菌數分別為2.9×108、5.3×108、4.7×108、3.8×108、4.3×108、3.6×108CFU/mL。以大豆蛋白胨為氮源的培養基，嗜酸乳桿菌生長狀態明顯優于其他成分的培養基，酶水解酪蛋白、乳清粉次之。

圖2 不同氮源對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.1.3 促生長因子優化結果

嗜酸乳桿菌依賴于培養基提供某些生長必需的維生素、氨基酸，在培養基中添加促生長因子，可提高氮源利用率，促進嗜酸乳桿菌生長。由圖3可見，MRS培養基為對照，添加量為1.0g/L的葉酸、生物素、維生素B1、天冬氨酸、賴氨酸時，嗜酸乳桿菌活菌數分別為3.0×108、4.7×108、5.5×108、4.2×108、6.1×108、5.6×108CFU/mL。以天冬氨酸為促生長因子時，嗜酸乳桿菌生長狀態明顯優于其他成分的培養基，賴氨酸、生物素次之。

圖3 促生長因子對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.2 正交試驗

根據上述單因素試驗結果，選擇乳糖、大豆蛋白胨、天冬氨酸進行三因素三水平正交試驗，考察碳源、氮源及促生長因子對嗜酸乳桿菌LA-Y26生長的影響。由表1可見，乳糖、大豆蛋白胨及天冬氨酸的影響順序為乳糖＞天冬氨酸＞大豆蛋白胨，較優組合為乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，按照最優組合進行三角瓶培養試驗，發酵液活菌數最高可達35.7×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵培養基優化正交試驗

2.3 嗜酸乳桿菌LA-Y26三角瓶培養條件優化

2.3.1 接種量優化

根據上述正交試驗最優結果配置培養基，分別按1.0%、3.0%、5.0%、10.0%接種量接種，37.0℃培養20h，發酵液在MRS瓊脂涂布計數。由表2可見，當接種量在3.0%時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵液活菌數最高可達37.5×108CFU/mL。

表2 不同接種量對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.3.2 初始pH值優化

根據上述試驗結果，調整發酵培養基初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0，按3.0%接種量接種，37.0℃培養20h，發酵液在MRS瓊脂涂布計數。由表3可見，當初始pH值在6.0時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵液活菌數最高可達42.7×108CFU/mL。

表3 不同初始pH值對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.3.3 培養溫度優化

根據上述試驗結果，按初始pH值6.0，3.0%接種量接種，調整培養溫度為28.0℃、32.0℃、37.0℃、42.0℃，培養20h，發酵液在MRS瓊脂涂布計數。由表4可見，當培養溫度為37.0℃時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵液活菌數最高可達43.9×108CFU/mL。

表4 不同培養溫度對嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.3.4 轉速優化

根據上述試驗結果，按初始pH6.0，3.0%接種量，培養溫度37.0℃，調整轉速為0、50、100、200r/min，培養20h，發酵液在MRS瓊脂涂布計數。由表5可見，當轉速為50r/min時，嗜酸乳桿菌LA-Y26發酵液活菌數最高可達63.1×108CFU/mL。

表5 不同轉速對失算乳桿菌LA-Y26活菌數的影響

2.3.5 嗜酸乳桿菌LA-Y26生長曲線

根據上述試驗結果，按初始pH6.0，3.0%接種量，培養溫度37.0℃，轉速50r/min，間隔2h取樣檢測發酵液OD600nm及活菌數，考察嗜酸乳桿菌LA-Y26最佳培養時間。由圖4可見，隨培養時間不斷增加，發酵液的OD600nm值和活菌數同步呈上升趨勢，培養6h嗜酸乳桿菌LA-Y26進入對數生長期，培養20h后進入穩定期。隨著培養時間的延長，發酵液的OD600nm及活菌數均呈略微下降趨勢，因此嗜酸乳桿菌LA-Y26最佳培養時間為20h。

圖4 嗜酸乳桿菌LA-Y26生長曲線及活菌數

2.4 20L發酵罐試驗結果

在20L發酵罐中，配置MRS培養基和優化培養基，按照相同的優化條件培養嗜酸乳桿菌LA-Y26。結果表明，使用優化后的培養基培養，嗜酸乳桿菌LAY26在20L發酵罐中的發酵液活菌數最高可達82.1×108CFU/mL，約為MRS培養基的40倍。

3 結論

本研究通過優化培養基及培養條件，實現了嗜酸乳桿菌LA-Y26的高密度培養，優化后培養基為乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，吐溫80 1.0mL/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸三銨2.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.05g/L；培養條件為初始pH6.0，接種量3.0%，溫度37.0℃，轉速50r/min，培養時間20h。在20L發酵罐中進行多次驗證試驗，發酵液活菌數最高可達82.1×108CFU/mL，約為MRS培養基的40倍。按優化后的培養基和培養條件進行多次500L、1000L發酵罐試驗，結果表明，發酵液活菌數比優化前水平有大幅度提升。

參考文獻：（略）