纖維素在固定化酶的研究進展

徐效，熊艷舒，黃可榆，謝彩鋒，2，3，4，杭方學，2，3，4，陸海勤，3，4，李凱，2，3，4

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.糖業及綜合利用教育部工程研究中心，廣西 南寧 530004；3.蔗糖產業省部共建協同創新中心，廣西 南寧 530004；4.廣西綠色制糖工程技術研究中心，廣西 南寧 530004)

酶作為一種生物催化劑，可在不改變化學平衡情況下提高反應速度，具有生物相容性、生物降解性[1]。近年來，酶因具有高效率、特異性強、反應條件溫和低能耗等優點，已被廣泛應用于基礎研究[2]和工業生產(食品、制藥、化妝品、紡織、造紙等多個領域[3-7])。隨著生物技術發展，酶在工業生產中占據地位日益重要，但穩定性差、回收率低、成本高及產量小等難題始終限制著游離酶在工業中大規模應用，為此，酶固定化技術應運而生。

酶固定化技術最早出現于1916年[8]。酶固定化技術是指選擇適當的固定化方法將游離酶固定在便于回收的載體上的一種生物技術，能夠使酶重復使用延長酶使用壽命，提高酶穩定性，進而明顯降低生產成本，顯著拓寬了酶應用領域。近幾十年來，固定化材料和酶工程領域的發展得到學者與生產企業廣泛關注，取得長足進步。目前酶的固定化方法主要通過物理(吸附、包埋)和化學相互作用(交聯、共價鍵)來實現，載體表面結構、疏水/親水性、物理化學穩定性、活性基團等特性及適合于不同酶制劑的固定化技術的選擇會影響固定化酶的強度和穩定性。因此，良好的固定化酶載體和先進的固定化酶技術是提高固定化酶品質的關鍵[9]。

纖維素是地球上最豐富的天然聚合物之一，廣泛存在自然界植物中，也可由藻類、被囊動物或特定細菌合成[10]。纖維素因其表面具有豐富的羥基等活性基團，能夠很好地與酶結合，因此可作為一種新型的固定化酶載體；另外因為纖維素材料來源豐富，可再生，成本低，并具有良好的生物降解性[11]，作為酶固定化材料應用具有廣泛發展前景。

1 酶的固定化載體

在工業生產中，大多數酶源自微生物，生物技術的發展使得酶在精細化學、食品、塑料、化妝品、藥物和生物燃料等領域應用已逐漸走向商業化[12-13]。游離酶雖然反應條件溫和，能夠提高反應效率，但是由于其在實際應用過程中不易從反應介質中分離影響產品品質，導致工業生產成本過高，嚴重限制其商業化應用。而固定化酶技術不僅能夠延長酶使用壽命，還可以降低酶的使用成本，為工業酶的研究打開了一條新路徑。在固定化酶技術中，固定化載體的研究至關重要。固定化酶載體本身的穩定性和機械強度會影響酶的可回收性，另外，載體的比表面積大小、多孔結構以及表面活性官能團與酶的負載量有著密切聯系。因此，固定化酶載體對最終形成固定化酶物化特性影響重大。固定化酶載體主要分為無機載體、合成聚合物載體及天然聚合物載體[14-17]。

1.1 無機載體

目前，用于固定化酶的無機載體材料主要包括二氧化硅、多孔玻璃、氧化鋁、硅藻土等[18]，二氧化硅材料因其比表面積和孔徑可控、制備簡單最受關注。典型的二氧化硅載體主要有介孔二氧化硅、硅膠、泡狀和氣相二氧化硅[19]，其中介孔二氧化硅載體固定化酶應用最廣泛[20]。

1.2 合成聚合物載體

合成聚合物載體具有多種化學基團和機械形態，可以根據酶的特性進行組合加工。常見的合成聚合物載體包括聚氯乙烯、聚氨酯微粒、聚乙烯醇和聚苯胺等[21]。環氧甲基丙烯酸酯作為一種工業生產常見環氧活化樹脂，具有良好機械強度，使用該材料固定酶可用于攪拌槽或流化床反應器[22]。

1.3 天然聚合物載體

天然聚合物載體是指從自然界獲得的聚合物，具有無毒、可生物降解、可再生等特性[23]。大多數無機及合成聚合物因可降解性差，易對環境造成污染，在倡導綠色環保的今天，天然聚合物作為固定化酶載體越來越備受關注。如今用于酶固定化天然聚合物載體主要有海藻酸鈉、殼聚糖、瓊脂糖、纖維素等。海藻酸鈉和殼聚糖是酶包埋中最常用的載體，酶的包埋率可以達到90%以上，且在不同pH及溫度條件下具有良好穩定性；但這兩種載體其孔徑大小較難控制，酶與底物不易接觸使反應不充分；另外，這兩類載體機械強度較小，在實際應用過程中載體容易破碎，使酶泄露出來[24-25]。瓊脂糖具有親水性、孔隙率高、機械強度大以及穩定性好等特點，用其來對酶進行固定，每克濕載體負載量最高可以達到100 mg；但瓊脂糖作為固定化酶的載體材料成本過高，不適合工業化推廣[26]。纖維素載體比表面積大、機械強度高的特性使酶能夠更多地附著其表面與底物充分接觸、多次重復使用，而且該載體材料來源廣泛可再生是現如今研究領域關注的重點，纖維素作為固定化酶的載體材料是很有發展潛力的。

2 纖維素載體的研究

纖維素固定化載體根據來源不同可分為木質纖維素載體與細菌纖維素載體。纖維素載體不僅活性基團多，而且還具有機械強度大、對酶溫和等特點[27]，同時更容易從環境中獲取，價格低廉。但在特定條件下纖維素表面羥基呈弱疏水性，其在某些領域工業應用受到限制，因此有研究者通過將纖維素表面羥基羧甲基化、乙酰化和硅烷化改性，開發出功能化纖維素載體[28]，或將纖維素與其他新型材料復合，以改善纖維素固定化載體性能，拓展其應用范圍。

2.1 木質纖維素載體

木質纖維素載體主要來源于木本植物、草類、農業廢棄物，這些原料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，不同原料各組分比例有所不同[29]。由于木質纖維素通常被半纖維素和木質素緊密包裹，一般采用堿法化學制漿、漂白、酶解和TEMPO氧化等工藝對木質纖維素原料進行預處理，通過溶解木質素和半纖維素來分離出纖維素，并制備木質纖維素載體[30]。同時，經分離提純處理后，纖維素載體表面會暴露更多的活性基團，可以與酶更好結合，因此固定化效果更好。Bezerra等[31]將椰子皮經堿法預處理獲得纖維素，通過乙二醛交聯固定化漆酶，固定化酶可保留初始活性的59%左右，熱穩定性也有所提高。然而，使用木質纖維素作為固定化酶載體存在著纖維素提純效率低、操作過程復雜等弊端。

近年來，以農業生產中的木質纖維素原料為載體的酶固定化技術已成為國內外研究熱點。Priyanka等[32]以椰子纖維為載體交聯固定化漆酶，提高了漆酶穩定性同時將酶的相對酶活提高至80%；Nuraliyah等[33]利用戊二醛(GA)使玉米殼纖維素交聯固定化脂肪酶，提高脂肪酶操作穩定性；另外，通過對木質纖維素進行功能化改性可提高固定化酶穩定性，使固定化酶能夠重復多次使用以降低成本。Luo等[34]通過環氧氯丙烷的氯基團和纖維素的羥基之間的親核反應將環氧基團引入纖維素，然后將青霉素G酰化酶(PGA)附著在環氧氯丙烷活化的纖維素微球上，固定化PGA表現出高效的催化活性以及熱穩定性。Cespugli等[35]通過高碘酸鹽氧化改性稻殼纖維素使其具有官能化醛基，用于固定化脂肪酶，與未經氧化改性的載體相比，改性后的酶負載量可提高至58%。陳輝等[36]在離子液體中用L-絲氨酸對提取菠蘿皮渣纖維素進行均相改性，并用于固定化菠蘿蛋白酶，與游離酶相比，固定化菠蘿蛋白酶具有更優的溫度及酸環境穩定性。研究與實踐表明，木質纖維素材料作為固定化酶載體有許多優勢：較大的比表面積可以提高酶負載量；材料表面的多孔結構可使酶的構象不易受損；纖維素表面豐富的活性基團可以通過離子交換、表面吸附、配位、絡合等復雜機理與酶相連接。這些優勢極大提高了載體負載酶的穩定性從而使固定化酶在反應介質中循環多次使用。

2.2 細菌纖維素載體

細菌纖維素(BC)是一種僅由葡萄糖單元和水組成生物材料，可以由微生物細胞在納米尺度上合成[37]。BC不含有木質素和半纖維素等雜質，結晶度更高，是以高純度的形式生產，不需要復雜繁瑣的預處理過程[38]。

相對于木質纖維素，BC具有高結晶度和高含水量的特點，熱穩定性更高；另外 BC還具有納米孔結構、比表面積大、游離羥基多等優點，因此BC被認為是新型的固定化酶載體。吳月紅等[39]采用細菌纖維素(BC)膜來固定化漆酶后，與游離酶相比，固定化漆酶對活性艷藍KN-R脫色率提高了2倍，反應速率提高了3倍。Dikshit等[40]利用木糖桿菌從生物柴油的粗甘油中生產細菌纖維素(BC)并固定化脂肪酶，該固定化酶在不同溫度下都具有較高的活性、pH范圍更廣泛，與游離脂肪酶相比，BC固定化脂肪酶具有較好穩定性和生物活性，可用于工業生產。Yu等[41]用APTES對BC進行了硅烷衍生物改性制備氨基官能化細菌纖維素，并用該載體固定辣根過氧化物酶(HRP)，相對活性為90%，高于游離酶，且經過10個反應周期相對酶活仍保持在70%以上。

2.3 纖維素復合材料

單一纖維素材料作為固定化酶載體存在不足，在工業生產過程中穩定性不高且不易與反應物分離，傳統分離技術(離心或納濾)會增加回收成本，為解決這些問題，科研工作者們對纖維素復合材料進行了重點研究。

Dai等[42]將菠蘿皮羧甲基纖維素、聚乙烯醇及介孔二氧化硅SBA-15水凝膠制成的復合材料用于固定化木瓜蛋白酶，與采用單一菠蘿皮羧甲基纖維素固定化木瓜蛋白酶相比，多種材料的復合使載體為酶提供了更多的附著位點，提高了酶的負載量，并且在80 ℃孵育2 h后，固定化木瓜蛋白酶活性保留56%，游離木瓜蛋白酶活性僅保留16%。儲存10 d后，固定化木瓜蛋白酶的初始活性保留79%，而游離木瓜蛋白酶的初始活性僅保留27%，固定化木瓜蛋白酶的熱穩定性和貯存穩定性均有所提高。

另外，磁性材料作為固定化酶載體具有潛在應用前景，將其與纖維素一起制備復合材料可以解決工業生產中分離成本過高問題。Drozd等[43]將細菌纖維素(從木糖科桿菌中獲得)氧化接枝聚乙烯亞胺，將與Fe2+和Fe3+混合合成的磁性細菌纖維素復合材料用于固定化脂肪酶，該固定化酶重復使用10次后相對酶活可達到65%，可通過外界磁場迅速將酶與反應介質分離。Suo等[44]制備了離子液體修飾的磁性羧甲基纖維素納米材料，并將其作為載體進行脂肪酶的固定化，其活性分別比游離脂肪酶和經羧甲基纖維素納米材料固定的脂肪酶高1.43倍和2.81倍，酶的穩定性提高顯著。經研究發現，磁性纖維素復合材料是一種固定化酶多功能載體，既具有磁性材料特性(如高比表面積及易分離)，又可與纖維素復合進行化學改性添加活性基團，更加適用于各式各樣工業生產環境。

3 結論與展望

本文介紹了纖維素作為固定化酶載體的研究進展。雖然單一纖維素材料作為固定化酶載體在實際應用中穩定性不高、不易分離、回收率效率低，但將纖維素改性或與其他材料復合可以極大提高固定化酶的穩定性和回收效率。因此，纖維素作為一種綠色環保的可再生資源用作固定化酶載體具有重要的研究價值。