產油微生物制備生物柴油的研究進展

姜巖，李玉欣，陳立功，李文杰

(1.重慶工商大學 廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067；2.哈爾濱工業大學(威海) 海洋科學與技術學院，山東 威海 264209)

生物柴油是一種重要的可再生能源，可以無限的生產，并具有許多環境友好的特性，如含硫量低、更易被降解，并且不包含對環境造成污染的芳香族化合物。由于用植物油為原料生產成本高且產量有限，而以餐飲廢棄油為原料，也存在原料難以收集等問題，利用微生物油脂發酵成了一個重要的研發方向[1-2]。

單細胞油脂的組成和一般植物油相近，以C16和 C18脂肪酸，如油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸等為主，但不飽和度更高[3]，因而生產的生物柴油的品質好[4]。利用微生物油脂制備生物柴油具有很多優勢，如：微生物生長迅速、生長周期短、生長原料廣泛且價格便宜；可以人工調控且需要勞動力少；受季節、場地、環境制約小；能連續大規模生產，生產成本較低[5]。因而通過微生物法制備生物柴油對柴油產業可持續發展具有重要意義。本文對產油微生物的種類、篩選和微生物柴油的制備流程進行了綜述，并對未來的研究方向進行了展望。

1 產油微生物的研究現狀

部分微生物在適宜條件下生產并儲存的油脂含量占其生物總量的20%以上，具有這種特性的菌株一般被稱為產油微生物[6]。目前，已發現的產油微生物包括酵母菌、霉菌、藻類和細菌等。其中，酵母菌作為單細胞真核微生物，常見的產油菌有產油油脂酵母(Lipomyceslipofer)、彎隱球酵母(Cryptococcusalbidum)、淺白色隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、彎假絲酵母(Candidacurvata)、斯達氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、膠粘紅酵母 (Rhodotorulaglutinis)、圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、茁芽絲孢酵母(Trichospironpullulans)、雙倒卵形紅冬孢酵母(Rhodosporidiumdiobovatum)等[7-8]，這類菌株細胞內油脂含量較高，可達菌體干重的30%～70%。霉菌是形成分支菌絲的真菌統稱。目前發現的常見產油霉菌有深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、葡酒色被孢霉(Mortu-erellavinacea)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、紫癜麥角菌(Clavicepspurpurea)、高梁褶孢黑粉菌(Tolyposporiumehrenbergii)等[9-10]。霉菌油脂含量約為菌體干重的20%～70%。此外，海洋中許多藻類都能產生油脂，其中微藻以其獨特的優點在產油藻類中凸顯出來，近年來成為了研究的熱點。微藻個體小，平均大約只有5 mm，生長繁殖快，對外界環境適應力強，在陸地、海洋分布廣泛，幾乎在有光和潮濕的任何地方，微藻都能生存，并且產油培養過程容易，對光的利用效率高。目前，已經發現了幾百種富油微藻，直接提取得到的油脂組分與植物油類似，可以作為植物油的替代品，更是優良的生物柴油生產原料。現已發現含油量較高的微藻有硅藻(Diatom)、綠藻(Chlorophyta)、葡萄藻(Botryococcusbraunii)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)、小球藻(Chlorellavulgaris)等[11]。藻類油脂含量約為菌體干重的25%～65%。相比之下，產油細菌油脂含量較低，為20%～40%，常見的有：分枝桿菌(Mycobacterium)和棒狀桿菌(Corynebacterium)等。細菌在高葡萄糖時產生不飽和甘油三酸酯，但大多數產油細菌不產甘油三酯，而是積累復雜類脂，如磷脂與糖脂。由于細菌油脂主要分布于細胞外膜上，所以提取較為困難，故很難應用于工業生產。

2 產油微生物的篩選與培養

野生型產油菌株往往效率很低，因而高效誘變株成為發展方向。

傳統誘變方法。即利用物理誘變劑(如α射線、γ射線、紫外輻射等)和化學誘變劑(如烷化劑、核酸堿基類似物等)等誘使微生物發生突變，進而篩選出高產油菌株的誘變方法。Yamada等[12]通過紫外線得到了誘變酵母突變株，產脂率是野生型的5倍。

針對微生物油脂代謝網絡，進行調整和結構優化，來提高細胞的油脂含量[8]。主要有以下幾種思路：①增加油脂合成相關酶的表達量。Zhang 等[13]使圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的乙酰CoA羧化酶和二酰基甘油酰基轉移酶基因過量表達，促使菌體油脂含量增加了2倍；②抑制脂肪酸β氧化途徑。Courchesne等[14]通過部分抑制β-氧化可增加細胞油脂含量；③抑制中間代謝產物流向其他分支途徑。Athanasios等[15]將編碼3-磷酸甘油脫氫酶的GUT2基因敲除，使Δgut2突變株的油脂含量增加了 3 倍。

用轉座子隨機插入基因組，從而找出油脂合成相關基因。Kamisaka等[16]則通過轉座子突變在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發現5個能促進菌體油脂含量積累的基因。這條研究路線得到了較好的處理效果。

3 生物柴油的制備

生物柴油制備的主要過程為：發酵→菌體的收集與預處理→油脂提取→生物柴油制備。

3.1 發酵

發酵過程作適當優化調整可以提高油脂含量。除了通過控制通氣量、溫度、pH、光照，還可以控制營養元素的比例或添加一些小分子物質來提高油脂含量。①調整C/N比例。李永紅等[17]發現C/N 比在一定范圍內增加時，圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)油脂含量也隨之增加，達到420 時，油脂含量達到最高值76%。②調整C/P比。李永紅等[17]還發現C/P比適度增加，也會提高菌體油脂含量。③調整C/S比。Wu等[18]在研究Rhodosporidumtoruloides時發現，S同樣起著很重要的作用，硫限制時，細胞油脂含量不再隨C/N而變化。④添加其他一些小分子物質。Papanikolaou等[19]發現加少量甜橙精油到Yarrowialipolytica的培養基質中，便能使產物中飽和脂肪酸含量大幅增加。

另外還可以應用不同發酵模式調控油脂發酵。通常利用微生物生產胞內產物，可以采用的培養方式有3種：批式培養、補料-批式培養和連續培養。其中補料-批式培養模式可方便控制限制因子濃度，獲得了廣泛應用。Liang等[20]利用粗甘油為碳源培養Cryptococcuscurvatus，發現補料-批式培養條件下，在培養結束時，菌體量和油脂含量均比批式培養高。

3.2 菌體預處理

油脂多包含在菌體細胞內，為了提高油脂的萃取率，有必要在提取油脂之前對菌體細胞進行預處理，使得內部油脂更容易釋放出來。菌體常見的預處理方法有：①基于機械剪切力的研磨、高壓、激光、超聲波、電場等；②反復凍融法，即利用低溫冰凍后生成的冰晶達到破壁目的；③與稀鹽酸共煮法，即是用一定濃度的稀鹽酸對菌體細胞進行處理，破壞其細胞壁結構，再加熱煮沸進一步使得細胞裂解；④菌體自溶法，如將酵母在50 ℃下保溫 2～3 d，自行消化后回收油脂；⑤酶處理法，即用細胞壁降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶等處理菌體；⑥有機溶劑處理，如利用乙醇或丙酮破壞細胞膜，使結合蛋白變性[21-23]。

預處理方法選擇上還要根據原料材質決定[24]，研發高效低成本的預處理技術對后續油脂提取很重要。

3.3 油脂提取

油脂提取也是制備生物柴油的關鍵環節，常用的方法包括有機溶劑法、索氏提取法、超臨界CO2萃取法(SFE)等。這些方法在諸多工業領域中應用，屬于通用技術。

3.4 化學法制備生物柴油

目前，生物柴油的制備方法主要有化學法、物理法、生物酶法三類，以化學酯交換法研究最為廣泛。該法是采用脂肪酸甘油酯和甲醇在催化劑的催化下進行酯交換反應，產生脂肪酸甲酯和甘油。

3.4.1 均相催化酯交換 通過加入鹽酸、硫酸、磷酸，或NaOH、KOH等均相酸或堿催化劑，使催化反應高效進行。與均相酸催化法相比，堿催化更快，約為酸催化劑4 000倍，但堿會與游離的脂肪酸發生皂化反應，發生乳化，使得催化劑不易去除，水又會促進甲酯的水解。均相酸催化法雖受游離脂肪酸影響小，但耗時較長，對設備有一定腐蝕，且耗用甲醇量較多，當體系中水和游離脂肪酸含量較高時，可考慮選擇酸催化劑催化[25]。

3.4.2 多相催化酯交換 多相催化法最大的優點在于大大方便了催化劑的分離，有利于去除游離脂肪酸雜質[26]。采用的催化劑常有硫酸化金屬氧化物、磺酸離子交換樹脂、磺酸改性介孔二氧化硅、磺化碳基催化劑等[27]，并且具有對設備腐蝕性小、環境污染小的優點。但反應速率較慢，主要是因為醇和油兩相不互溶，阻礙了反應的進行。夏禹杰等[28]使用雙醚類物質作為共溶劑，使甘油三酸酯和低級醇形成均相反應體系，從而增大了反應界面，加快了反應速度。

3.4.3 亞臨界酯交換法 在溫度接近甲醇超臨界溫度下，催化酯交換反應，在一定程度上彌補了均相、多相催化酯交換和超臨界酯交換的缺陷。該方法使用固體催化劑，使后續的催化劑分離更加容易；在亞臨界狀態下甲醇和油脂的互溶度增加，提高了反應速度；對原料的含水量、酸值要求不高，降低了預處理等成本；解決了高溫高壓問題，對設備的要求降低[29]。

3.4.4 超臨界酯交換法 甲醇在超臨界狀態下與油脂的互溶度極大增加，甲醇既是反應物又是催化劑，使分離更加簡單；反應對油脂要求低，使預處理簡單。此外，甲基酯的轉化率高，并且對環境污染小。主要的缺點為反應是在高溫高壓下進行，對設備條件要求高，使大規模應用受阻。Kusdiana等[30]提出超臨界流體二步法，即水解、酯化二步法合成生物柴油的工藝。首先將油脂在亞臨界狀態下水中水解成脂肪酸，脂肪酸在超臨界甲醇條件下發生甲酯化反應生成脂肪酸甲酯。此法的脂肪酸與甲醇發生酯化的溫度壓力條件更溫和，但工藝流程變得相對復雜，目前研究還不夠深入，在未來此種改進方法可能會有很好的應用[31]。

4 結束語

開發綠色替代能源已經成為發展趨勢。微生物油脂以其獨特的優點很可能成為生物柴油的重要原料來源，然而以微生物油脂為原料的第三代生物柴油技術還未成熟，原因在于生產成本較高、不能高效規模化生產采集油脂。未來可從以下幾方面進行研究：

(1)尋求更加廉價而高效的原料用于產油微生物發酵。

(2)繼續深入研究產油微生物的篩選、改良和培育，最好能結合處理有機廢棄資源，創造更加經濟環保的生產方式。

(3)對微生物油脂合成代謝網絡繼續深入分析，找到關鍵因素，在提高油脂產量上，找到新突破口。

(4)優化工藝，探求可廉價高效提取微生物油脂的新方法。