“紫外-可見分光光度法測定藥材的多糖含量”開放性實驗的設計*

李 燕，嚴萬莉，曾紫微，肖 竦，何 彬

(貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025)

近年來，國家高度重視創新型人才的教育和培養[1]。大學生畢業出來是服務于社會，引領社會的發展的，所以國家一直致力于培養創新型人才。但是不得不承認，許多高校的發展落后于社會的發展，在科技技術不斷進步的今天，各大企業有了更新的運營模式，更新的儀器設備，而大多數高校仍然在傳授多年前就很成熟的各種理論知識，而本來就少的實驗課也是“照葫蘆畫瓢”，只要跟著書本實驗步驟做，基本不會出錯，從各方面來說，都是不利于社會的發展的[2]。特別是藥學專業的學生，不僅要求學生掌握扎實的基礎和較廣的知識面，還需要具備較強的創新意識，這樣才能適應大學畢業以后，成為復合型的高素質的藥學人才，從事藥學相關的研究開發、教育及質量控制等方面的工作，服務于國家經濟社會建設主戰場。

傳統的教學模式雖然能達到教學的目的，但是“照本宣科”式的教學，容易忽視學生分析問題、解決問題的能力和創新能力的培養[3]。雖然，藥學專業課程設置包括了眾多科目的基本理論知識以及實驗課程，然而，大部分實驗課程均為基本的單元操作實驗，極少涉及綜合性實驗或者自主創新實驗；大部分實驗也與社會實際工作內容相距甚遠。現有實驗課程與藥學專業學生的培養目標還有一定的差距和不足，有必要進行一些新的實驗教學改革和嘗試。為了提高藥學教育的實驗教學質量，我們設置了不同類型的開放性實驗，讓學生自主學習、自主操作的能力得到提高。本文提出針對多種中藥材的多糖含量測定設計開放性實驗，以培養學生發現、分析、解決問題的能力。

多糖通常指的是10個以上的單糖通過苷鍵共價連接的一類生物大分子代謝物，在多種中藥材中，都含有多糖。最初，人們認為多糖的活性不強，在制備中藥提取物的過程中，多糖常常作為雜質被除掉。20世紀70年代以后，許多研究發現多糖廣泛參與了細胞生命的生理調節，在許多過程中都發揮了相當重要的作用：抗氧化損傷[4-5]、抗癌抗菌[6]、抗炎[7]等。比如靈芝多糖就是靈芝中最有效的成分之一，其具有多種藥理活性，如提高機體免疫力、抗腫瘤、抗輻射等作用[8]；鐵皮石斛多糖同樣是鐵皮石斛的主要有效成分之一，其除了有免疫調節功能、抗腫瘤功能，還具有降血糖、抗氧化、抗衰老的作用[9]。所以，對于不少中藥材來說，其多糖含量也是中藥材質量控制的標準之一。本文以靈芝多糖為例，以紫外-可見分光光度法來測定靈芝多糖的含量[10]，開展開放性實驗。

1 實驗設計

1.1 實驗目的

(1)培養學生自主學習、自主查閱資料的能力。

(2)培養學生熟悉紫外-可見分光光度計的原理和操作。

(3)培養學生掌握紫外-可見分光光度計法測定不同藥材的多糖含量。

1.2 實驗原理與方法

(1)原理

紫外-可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外-可見輻射光后，發生了電子能級躍遷而產生的吸收光譜。由于各種物質具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結構，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測定該物質的含量[11]。

硫酸蒽酮法是測定多糖含量的較為常用的方法，其原理是：多糖類在濃硫酸的作用下水解為單糖，然后迅速脫水生成糠醛衍生物，其與蒽酮結合成有色化合物，而且在適當波長下和一定濃度范圍內其顏色深度(吸光度值)與單糖含量成線性關系，從而可以通過比色測定其多糖含量[12-13]。

(2)方法

本實驗采用了靈芝粉末，運用紫外-分光光度法來測定多糖的總含量。以不同濃度無水葡糖為對照品溶液繪制標準曲線，將靈芝供試品溶液所測吸光度代入標準曲線中，計算出靈芝多糖含量。

(3)儀器

UV-2700紫外分光光度計；石英比色皿；移液管；分液漏斗；水浴鍋；分析天平；濾紙；干燥箱；洗耳球；漏斗；圓底燒瓶；冷凝管；具塞試管；容量瓶。

1.3 實驗內容

(1)供試品的前處理

對于未粉碎的供試品，小于500 g時全部用切片機切片，混勻，用四分法縮分至約100 g；送檢樣品大于500 g，混勻，隨機分取500 g，切片，混勻，用四分法縮分至約100 g?？s分的樣品置60 ℃烘箱中干燥4 h，粉碎，全部過三號篩，封裝于塑料自封袋中，干燥處保存。

對于粉末供試品，全部過三號篩，不通過部分，粉碎，過三號篩，封裝于塑料自封袋中，干燥處保存。

(2)對照品溶液的制備

取無水葡萄糖對照品適量，精密稱重，加蒸餾水配成每 1 mL含0.12 mg的溶液。

(3)標準曲線的繪制

精密量取對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于10 mL帶塞試管中，然后加蒸餾水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻)6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

(4)供試品溶液的制備

取本品粉末約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水 60 mL，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用水5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻，在4 ℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

(5)多糖含量測定

精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計算，即得。

①打開紫外-可見分光光度計電源15 min以上；

②用相應的空白溶液分別洗滌兩個比色皿各三次，在兩個比色皿分別加入空白溶液至比色皿高度的2/3以上；

③將兩個盛有空白溶液的比色皿置分光光度計樣品和參比光路上；

④在625 nm處進行調零；

⑤取出樣品光路中的比色皿，用待測標準溶液潤洗比色皿三次，加入待測標準溶液至比色皿高度的2/3以上；

⑥在625 nm處測定吸光度值；

(3)將測試集數據輸入到作者身份識別模型中，運用MATLAB進行求解。通過將作者身份識別模型中識別的電子郵件正確數除以模型中總的郵件識別數，得到郵件識別的準確率，以此來衡量研究的準確性。并對程序運行的結果進行分析，得到該方法的識別準確率。

⑦繪制標準曲線(注：相關系數達0.99以上)；

⑧取出樣品光路中的比色皿，用待測供試品溶液潤洗比色皿三次，加入待測供試品溶液至比色皿高度的2/3以上，在625 nm處測定吸光度值；

⑨從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖(C6H12O6)的量，計算，即得。

(6)多糖含量的計算

取出樣品光路中的比色皿棄去標準品溶液，用空白溶液洗滌樣品比色皿三次，再用待測供試品溶液洗滌樣品比色皿三次，加入待測供試品溶液至比色皿高度的2/3以上，在625 nm處測定吸光度；

記錄并根據下式計算靈芝多糖的含量：

靈芝多糖的含量={(m×V1×V3)/ (V2×V4×W)}×10-6×100%

式中：W代表精密稱定靈芝細粉的質量，g；m代表測定的供試品溶液的質量，μg；V1為供試品體積，mL；V2為量取供試品體積，mL；V3為稀釋后體積，mL；V4為量取稀釋后體積，mL。

1.4 思考題

(2)思考選擇在625 nm波長處測定吸光度的依據。

(3)如果靈芝供試品所測得的吸光度不在標準曲線范圍內，應該采取的措施。

(4)比較紫外-可見分光光度法與HPLC法、以及其他方法的優缺點，以及硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法的區別及其優缺點。

(5)如果要測定其他中藥材，比如鐵皮石斛和人參，嘗試合理設計實驗。

2 實驗的可行性

2.1 實驗特點

為了解決傳統教學模式單一等問題，采取開放性實驗來打破學生“被動”吸收知識的困境，培養學生發揮積極的主觀能動性和創新性。

此次的開放性實驗是關于中藥材的多糖含量測定，多糖含量測定的實驗是具有其價值和意義的，多種中藥材的多糖含量也是中藥材質量控制的標準之一，所以實驗內容的選取是符合我們將理論知識運用于實踐的。根據糖的理化性質和化學性質，許多多糖含量測定方法被設計出來，在一定范圍內是可以達到測定的目的要求的。多糖含量測定方法包括了比色法、滴定法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、高效毛細管電泳法(HPCE)等方法。其中，比色法使用最為悠久，也是目前最廣泛的多糖含量測定方法，特別是蒽酮-硫酸法應用最廣泛。當然，針對中草藥藥材的多糖含量測定方法各有優缺點，具體的多糖含量測定方法的選取需要根據選定藥材的多糖及其他化學成分的性質來決定。此外，多糖含量測定方法也會存在一些挑戰，比如，不同多糖含量測定方法的標準品的選擇、最大檢測波長的選擇、線性濃度范圍、顯色后的穩定性、顯色時長、藥材中各組分之間的干擾等等問題。因此，在多糖含量測定的過程中應排除其他水溶性成分的影響，特別是一些中性糖和酸性糖的相互干擾?？偟膩碚f，以靈芝多糖含量測定為例，開展的開放性實驗，本實驗操作簡單，但需學生獨立實驗，熟知相關理論知識和儀器操作，能讓學生從理論知識到實踐的鍛煉。

2.2 實驗可行性

2020年版《中華人民共和國藥典》中收載了各種中藥材的多糖含量測定方法和相關的標準規定，包括靈芝、人參、枸杞、當歸、玉竹、鐵皮石斛、昆布、黃精、海藻等多種中藥材的多糖含量測定；也有大量的文獻報道了多糖含量測定的方法學研究。雖然，各種藥材的多糖測定方法不盡相同，但是，總的來說，基本上運用到的都是比色法原理進行測定，即通過糖分子發生氧化還原反應以后，再與顯色劑反應生成有色化合物。這就要求利用標準品進行線性范圍考查獲得標準曲線，在線性范圍內的標準曲線區間，獲得多糖含量在理論上具有非常強的可行性。對于此次實驗所用到的各種儀器，以及各種試劑，均是易得且實驗室已具備的，方便學生隨時可以操作。在實驗過程中，針對已提出的思考題，學生需要查詢大量資料方能解決，幫助學生熟悉理論知識，通過學生親自配置對照品溶液、標準品溶液以及供試品溶液等多個步驟，有利于提高學生的動手操作能力。在實驗的過程中，經過討論，學生能熟練掌握紫外-可見分光光度計的工作原理及具體操作步驟，動手能力與獨立思考的能力明顯提高，達到了開設開放實驗的目的。

3 結 語

開放性實驗教學是實驗教學改革和發展的內在要求，也是為了適應創新型和應用型人才培養的時代需要，配合學校藥學專業本科培養計劃的實施，深化實踐教學改革，培養學生的創新意識和實踐能力，進行日?？蒲泻徒虒W工作的交叉融合，充分挖掘和優化資源配置，提高教學質量。通過該開放性實驗的開設，面向藥學專業學生，我們為學生提供了一個實驗的平臺，給學有余力的學生一個自主發展和實踐鍛煉的機會，強調多學科知識點的交叉融合，強化基礎，著眼應用，拓寬學生的知識面，靈活了個性化教學的多樣性。在實驗過程中，學生可以獨立自主完成實驗，掌握紫外-可見分光光度計的原理及操作過程，提高學生實驗的參與度，以及對實驗的積極性，培養學生綜合運用知識的能力。經反饋，學生很認可這種開放性實驗，收益很大，學生們的動手能力、實驗操作技能都得到了普遍的提高，并認為這種模式的教學能讓他們學以致用。