基于網絡藥理學的黨參抗氧化損傷研究

廖江敏，朱 彤，楊雪峰,2，冷崇姣,2，楊軍宣*

1重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016；2重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶 402160

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.) L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根[1]。黨參是我國常用的一種補益類中藥，主要含有糖類、生物堿類、聚炔類、苷類及萜類等成分，具有調節血糖、促進造血機能、抗缺氧、抗應激、抗疲勞、增強機體免疫力、延緩衰老、調節胃收縮、保護胃腸道黏膜及抗潰瘍等多種藥理作用[2]。截至目前，黨參藥材缺乏性質穩定、具有專屬性且與臨床功效緊密關聯的標志性活性成分研究，這也成為制約黨參藥材全面質量控制的瓶頸。

網絡藥理學為中藥復雜體系研究提供了強有力的方法和工具，該方法應用于中藥復方配伍規律的闡釋、活性成分篩選、藥效物質基礎研究及作用機制研究等，取得了一系列研究進展[3-5]。但是，目前網絡藥理學仍然面臨一些挑戰，例如采用網絡藥理學針對疾病篩選出的活性成分并非是中藥材現行標準中的主要質控成分或藥材中含量較高的成分，現有的實驗基礎表明，通過網絡藥理學篩選得到的部分成分在原藥材或原復方中含量較低[6]。所以為了尋找更有價值的黨參活性成分，本文通過查閱文獻，查找黨參中可HPLC分析的多種成分，采用網絡藥理學方法，以“氧化應激”為檢索詞，對多個單體進行抗氧化應激的主要作用機理的探討；并以H2O2誘導的RAW 264.7細胞為模型，驗證黨參中活性成分的抗氧化作用，為黨參藥材的質量控制提供參考。

1 材料及方法

1.1 數據庫和軟件

PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；Swiss Target Prediction(http://swisstarget prediction.ch/)網站；CTD比較毒物基因組學數據庫(CTD，Comparative Toxicogenomics Database，https://ctdbase.org)；Metascape(http://metascape.org)；STRING(https://string-db.org/)數據庫；Cytoscape3.8.0軟件。

1.2 細胞株

小鼠RAW 264.7巨噬細胞株，購自重慶金喜鵲科技發展有限公司，實驗室液氮罐長期保存。

1.3 儀器與試劑

Synergy HTX全自動酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：1609131B)；低溫高速離心機(杭州奧盛儀器公司，型號：ICEN-24R)；低速離心機(長沙湘儀離心機儀器公司，型號：TGL-16M)；超凈水產生系統儀器(重慶奧思德儀器設備公司，型號：AS-S20-R)；梯度PCR儀(美國Bio-rad公司，型號：CFX ConnectTMOptics Module)；NANODROP 2000 微量核酸蛋白測定儀(美國 Bio Tek 公司，型號：P6730)。

黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：wkq21041905、wkq21022507、wkq21050607，≥98%)；胎牛血清(FBS，北美維森特，批號：086110054)；DMEM(美國Gibco，批號：8121295)；雙抗(上海碧云天，批號：C022)；無血清凍存液(中國新賽美，批號：C40100)；CCK-8(北京金克隆，批號：20210531)；引物(北京擎科，批號：TSC0004)；Steady Pure快速RNA提取試劑盒(中國艾科瑞，批號：A3A0944)；M5 Super plus qPCR RT kit-with gDNA remover Ta KaRa(北京聚合美，批號：MF166-plus-T)；2X M5 HiPer SYBRP remix EsTaq(北京聚合美，批號：MF787-T)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天，批號：P0010)；Nrf2抗體(核因子紅系2相關因子2，ABclonal，批號：A1244)；Keap1抗體(樣環氧氯丙烷相關蛋白-1，ABclonal，批號：A1820)；二抗(武漢三鷹，批號：SA00001-1)；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，ABclonal，批號：AC033)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號：G0109F)；過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號：G0105F)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號：G0101F)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號：G0204W)。

1.4 方法

1.4.1 Swiss target prediction預測10個單體靶蛋白

通過PubMed數據庫查找黨參炔苷、紫丁香苷、黨參苷 Ⅰ、心葉黨參炔苷A、黨參炔醇、黨參炔苷寧、L-色氨酸、管花黨參堿B、管花黨參堿A、心葉黨參炔苷B 10個單體的Canonical SMILES式，分別導入Swisstarget prediction網站，選擇Homo sapiens預測其所有蛋白靶點。

1.4.2 氧化應激相關蛋白靶點查找

CTD數據庫中，以“oxidative stress”為檢索詞，在線獲取包括Genes、Go Terms和Pathways所涉及的所有氧化應激相關靶點。

1.4.3 蛋白互作分析

將取交集后的蛋白靶點導入STRING數據庫，設置物種為人，進行蛋白互作分析，下載TSV格式文件，再導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網絡。使用Cytoscape 3.8.0的插件Network analyzer，分析蛋白互作網絡，設置節點的顏色和大小來反映degree值。

1.4.4 GO富集分析

為了進一步探討黨參中10個單體抗氧化損傷的機理，使用Metascape數據庫，對交集蛋白靶點進行GO富集分析，初步探索黨參中主要潛在活性成分抗氧化損傷的作用機制。

1.4.5 CCK-8檢測3個單體對H2O2誘導的RAW 264.7細胞的影響

取生長狀況良好的細胞，在96孔板中，以1×104個/孔接種細胞，每孔100 μL。根據前期檢測結果，選定H2O2的干預濃度為490 μmol/L，分別設置空白調零孔組、空白對照組、H2O2組、H2O2+黨參炔苷(100、200 μmol/L)組、H2O2+紫丁香苷(100、200 μmol/L)組、H2O2+L-色氨酸(100、200 μmol/L)組，種板同時分別加相應濃度的黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸預處理24 h。每組6個復孔。24 h后，向每孔(除空白調零孔、空白對照組外)，其余組均加入490 μmol/L的H2O2，繼續培養24 h。24 h后，吸掉舊含H2O2培養基，加入10%的含CCK-8的新鮮培養基100 μL，于培養箱繼續培養3 h。避光條件下取出孔板，打開酶標儀設置相關檢測參數，進行吸光度檢測(A)。最后根據所得結果計算各組細胞存活率，細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As實驗孔，Ac對照孔，Ab空白孔。重復3次以上實驗步驟。

1.4.6 抗氧化酶活性測定

取生長狀況良好的細胞，在6孔板中，以2.5×105/mL，每孔2 mL進行種板。種板同時用黨參炔苷(100、200 μmol/L)、紫丁香苷(100、200 μmol/L)、L-色氨酸(100、200 μmol/L)分別刺激RAW 264.7細胞24 h(除H2O2組和空白對照組外)。然后將H2O2組和黨參炔苷(100、200 μmol/L)、紫丁香苷(100、200 μmol/L)、L-色氨酸(100、200 μmol/L)處理組分別暴露于H2O2(490 μmol/L)24 h。24 h后，用1 mL/孔PBS洗細胞2次，再加2 mL/孔PBS分別收集細胞于5 mL EP管中，用一次性PU手套包著于液氮和37 ℃水浴鍋反復凍融5次，再4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清于1.5 mL EP管中，根據制造商的說明書，使用試劑盒測定細胞中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的活性。

1.4.7 實時熒光定量PCR

取生長狀況良好的細胞，在6孔板中，以2.5×105/mL，每孔2 mL進行種板。細胞分組與加藥同“1.4.5”，在加藥干預完成后，根據各試劑盒說明書依次提取RNA；測RNA濃度、逆轉錄；擴增。反應結束后確認熒光定量PCR的擴增曲線和融解曲線，根據Ct值進行數據分析，重復3次。

1.4.8 蛋白質印跡分析

選取生長良好的細胞，細胞分組與加藥同“1.4.5”，用50 mL培養瓶培養各組別細胞，在加藥干預完成后，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書操作步驟測定各蛋白濃度，蛋白定量后，上樣進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上。采用TBS漂洗PVDF膜5 min后放入封閉液中，4 ℃孵育一抗(Nrf2、Keap1、GAPDH稀釋比例為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000)，置于搖床上過夜且平緩搖動。置于搖床上室溫平緩搖動2 h進行二抗孵育(稀釋比例1∶2 500)，化學發光、顯影，定影并拍攝膠片。

2 結果

2.1 10個單體預測靶蛋白

10個單體共預測到214個靶點，如圖1中綠色節點所示。其中心葉黨參炔苷A、管花黨參堿B在PubMed中沒有收載其化學式，黨參苷 Ⅰ 在Swiss Target Prediction中沒有預測到靶點。黨參炔苷預測到8個靶點，紫丁香苷31個，心葉黨參炔苷B 8個，L-色氨酸49個，黨參炔醇84個，管花黨參堿A 32個，黨參炔苷寧1個。如圖1所示。其中紅色代表黨參炔苷(lobetyolin)、L-色氨酸(L-tryptophan)、紫丁香苷(syringin)、心葉黨參炔苷B(cordifolioidyne B)、黨參炔醇(lobetyol)、管花黨參堿A(codonopyrrolidium A)、黨參炔苷寧(lobetyolinin)共7個單體。

圖1 單體預測靶點Fig.1 Monomers target prediction

2.2 氧化應激相關靶蛋白

在CTD數據庫中共檢索到氧化應激相關靶點881個。包括：直接獲得的24個；通過42個GO Terms條目獲得蛋白857個。

2.3 蛋白互作分析

黨參7個單體預測蛋白靶點與氧化應激相關蛋白靶點取交集后得到33個交集靶點(見表1)。利用STRING數據庫，設置“Highest confidence 0.9”，對交集蛋白靶點作蛋白互作分析后，得到蛋白相互作用關系圖，其中TACR1、ADA和CAMKK2與輸入的其他蛋白靶點之間沒有相互作用，隱藏沒有連接Nrf2 and Keap1 protein expression levels的靶點，余25個節點，其中MMP9、MMP3、MMP2與其他蛋白靶點不存在相互作用，故刪除，還剩22個節點，將下載的TSV文件導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網絡圖(見圖2)。圖中節點表示交集蛋白靶點個數，邊表示各靶點之間的關系。如圖所示，共有節點22個，邊49條。

表1 黨參中7個單體抗氧化應激靶蛋白Table 1 Seven monomeric anti-oxidative stress target protein sin Codonopsis Radix

續表1(Continued Tab.1)

利用Cytoscape 3.8.0，分析網絡中節點的Degree值，用節點的大小和顏色深淺來反映degree值的大小，degree值越大，節點越大、節點顏色越由淺紫色接近深紫色。由圖2可知，基因AKT1、CASP3、APP、MAPK1、MAPK8、MAPK3、LCK等聯系緊密。

圖2 交集靶蛋白的蛋白質相互作用網絡Fig.2 Protein-protein interaction network of intersecting target proteins

2.4 GO富集分析

為繼續探究黨參中潛在活性單體抗氧化損傷的作用機制，利用Metascape平臺將7個單體氧化應激蛋白質相互作用網絡中33個靶蛋白，進行GO富集分析。展示(P<0.01)前20個富集結果(見圖3)。

圖3 GO富集分析(FDR<0.01)Fig.3 Go enrichment analysis(FDR<0.01)

GO富集分析的結果表明，共涉及到生物過程的條目有20個：細胞對化學應激的反應、細胞對氮化合物的反應、細胞死亡的正向調節、蛋白質磷酸化的調節、蛋白水解的調節、酶聯受體、蛋白信號通路的調節、細胞定位的調節、凋亡信號通路的調節、肽的正向調節、蛋白質磷酸化的正向調節、造血或淋巴器官發育、細胞組織的正向調節、對激素的反應、對紫外線的反應、肽基絲氨酸修飾、對營養水平的反應、腺體發育、對生長因子的反應、調節平滑肌細胞增殖。共涉及的分子功能條目有14個，其中與結合相關的條目有8個，有泛素蛋白連接酶結合、蛋白結構域特異性結合、DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、染色質結合、蛋白質N末端結合、血紅素結合、鈣調素結合。涉及與活性相關6個條目，有蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、內肽酶活性、MAP激酶活性、酶激活劑活性、組蛋白激酶活性。涉及細胞組分7個條目，包括胞質溶膠和細胞質部分等。膜筏、囊泡腔、中心體、突觸后、內吞囊泡、轉錄調節復合物、質膜細胞質側的外在成分。

2.5 CCK-8檢測3個單體對H2O2誘導的RAW 264.7細胞的影響

由圖4可知，與空白組(Con)對照相比，模型組(H2O2)490 μmol/L干預24 h后，細胞增殖明顯抑制(P<0.01)。黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷分別100、200 μmol/L均可抵抗H2O2對RAW 264.7細胞的抑制(P<0.05)。

圖4 3個單體對H2O2誘導的RAW 264.7細胞的影響Fig.4 Effects of three monomers on H2O2 induced RAW 264.7 cells注：Con為空白組；H2O2為模型組；A、B分別為黨參炔苷100、200 μmol/L+ H2O2；C、D分別為L-色氨酸100、200 μmol/L+ H2O2；E、F分別為紫丁香苷100、200 μmol/L+ H2O2；與H2O2組相比，*P<0.05， ***P<0.001，下同。Note:Con is the blank group,H2O2 is the model group group;A,B are lobetyolin 100 and 200 μmol/L + H2O2,respectively;C,D are L-tryptophan 100 and 200 μmol/L + H2O2,respectively;E,F are syringin 100 and 200 μmol/L + H2O2,respectively;Compared with H2O2 group,*P<0.05,***P<0.001,the same below.

2.6 抗氧化酶活性測定

由圖5a、5b可知，與空白對照組比較，H2O2干預24 h后，CAT、GSH-Px含量明顯降低(P<0.01)，與H2O2組相比，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L組的CAT、GSH-Px活性顯著增加(P<0.001)，而L-色氨酸200 μmol/L無明顯影響。如圖5c所示，與空白對照相比，在H2O2處理24 h后，MDA水平顯著上升(P<0.01)，與H2O2組相比，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可顯著降低H2O2引起MDA升高(黨參炔苷100 μmol/L組P<0.05，其他組P<0.001)。如圖5d所示，與空白對照相比，在H2O2處理24 h后，SOD水平顯著下降(P<0.01)，與H2O2組相比，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可顯著提高H2O2引起SOD降低(P<0.001)。

圖5 抗氧化酶活力Fig.5 Antioxidant enzyme activity

2.7 實時熒光定量PCR

如圖6所示，與空白組相比，在H2O2干預24 h后，H2O2組Keap1(樣環氧氯丙烷相關蛋白-1)、Nrf2(核因子紅系2相關因子2)、NQO1(醌氧化還原酶)、HO-1(血紅素加氧酶1)、GCLM(谷氨酸-半胱氨酸連接酶調節亞基)、GCLC(谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基)的mRNA表達水平均提高(P<0.01)，黨參炔苷100、200 μmol/L，L-色氨酸100 μmol/L、紫丁香苷100 μmol/L均可顯著降低H2O2引起的Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM、GCLC的mRNA表達水平均提高(P<0.05)。紫丁香苷200 μmol/L對H2O2引起的Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM、GCLC的mRNA表達水平升高無顯著性影響。L-色氨酸200 μmol/L對H2O2引起的Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM、GCLC的mRNA表達水平升高也沒有顯著性影響，只對H2O2引起的NQO1的mRNA表達水平升高有顯著抑制作用(P<0.001)。

圖6 Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLC、GCLM的mRNA表達水平Fig.6 mRNA expression levels of Keap1,Nrf2,NQO1,HO-1,GCLC and GCLM

2.8 蛋白質印跡分析

由蛋白印跡分析(見圖7)可知，與空白對照相比，在H2O2干預24 h后，H2O2組Nrf2蛋白水平明顯下調，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可明顯上調H2O2引起的Nrf2蛋白水平下調。與空白對照相比，在H2O2干預24 h后，H2O2組Keap1蛋白水平均有明顯上調，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可明顯下調H2O2引起的Keap1蛋白水平上調。

圖7 Nrf2和Keap1蛋白表達水平Fig.7 Nrf2 and Keap1 protein expression levels

3 討論與結論

根據網絡藥理學預測結果，心葉黨參炔苷A、管花黨參堿B在PubMed中沒有收載其化學式，黨參苷Ⅰ 在Swiss Target Prediction中沒有預測到靶點，黨參炔苷寧1個。10個單體中可能有抗氧化作用的成分為：黨參炔苷、紫丁香苷、心葉黨參炔苷B、L-色氨酸、黨參炔醇、管花黨參堿A。而黨參炔苷、黨參炔苷寧、黨參炔醇、心葉黨參炔苷 B同屬于黨參炔烯類成分[2]，紫丁香苷為苯丙素類成分[7]，L-色氨酸、管花黨參堿A為生物堿類成分[7]。本文選擇黨參炔烯類成分中黨參炔苷，苯丙素類成分中紫丁香苷，生物堿類成分中L-色氨酸為代表，針對Nrf2-Keap1信號通路進行抗氧化應激作用的體外實驗研究。通過構建體外H2O2誘導RAW 264.7細胞氧化損傷模型，探討對該模型的保護作用和對Nrf2-Keap1途徑的影響。

在黨參的藥理作用中，抗應激、延緩衰老、保護胃腸黏膜、抗疲勞和抗缺氧等與抗氧化的藥理作用有一定聯系[8-11]，所以本文以“氧化應激”為檢索詞，采用網絡藥理學方法，對黨參抗氧化應激的作用機理進行探討。

黨參7個成分預測靶蛋白與氧化應激相關蛋白進行交集后獲得33個黨參抗氧化損傷靶蛋白。對33個交集靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，其中AKT1、CASP3、APP、MAPK1、MAPK8、MAPK3、LCK聯系緊密。NFE2L2、KEAP1是Nrf2-Keap1途徑重要分子，而APP、CASP3、CASP6、SYK、AKT1、GSK3B、MDM2、MMP2、PARP1、HSPA8、CDK2可通過激活MAPK1/MAP2K1/MAPK3/MAPK9/MAPK8等信號通路激活Nrf2信號途徑。因此推測Nrf2-Keap1可能是黨參中潛在活性成分發揮抗氧化損傷作用的重要途徑。LCK、JAK2、EGFR這些黨參活性成分靶蛋白均與免疫炎癥關系密切，提示黨參亦可能通過調節免疫炎癥起到抗氧化損傷作用。GO富集分析黨參潛在活性成分抗氧化應激33個靶蛋白，提示這些靶蛋白可能通過蛋白激酶活性、藥物結合、核苷酸結合等分子功能，以及細胞對含氧化合物的反應和調控細胞生物過程發揮抗氧化損傷作用。

在體外實驗的預實驗中，篩選出490 μmol/L H2O2作為后期干預濃度，且發現100、200 μmol/L的黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷干預24 h對RAW 264.7細胞增殖均無明顯影響，故后期使用100、200 μmol/L的黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷作為實驗濃度。

He等[12]對黨參中黨參炔苷和紫丁香苷進行了含量測定，分別為404.71±5.90、25.23±0.21 μg/g。Gao[13]分別對烘干、曬干和陰干黨參中黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸含量進行了測定，分別為：黨參炔苷1134.7、1581.3、1985.7 μg/g，紫丁香苷7.3、27.6、121.6 μg/g，L-色氨酸96.9、135.0、148.7 μg/g。說明黨參中黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸含量均可定量。

綜上所述，本文采用網絡藥理學方法預測黨參中主要潛在活性成分抗氧化應激的主要機制，通過細胞實驗，驗證了其中代表性成分黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷對H2O2作用的RAW 264.7細胞的影響，研究結果為黨參藥材、飲片及制劑的質量控制提供參考。