基于網絡藥理學和實驗驗證探討黃芪散治療阿爾茨海默病的作用機制

張運輝，楊夢琳*，周小青，伍大華,3，劉 霞，李 祥

1重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 404120；2湖南中醫藥大學，長沙 410208；3湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410006

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進行性認知功能障礙和精神行為損害為主要表現的中樞神經變性病。隨著人口老齡化的進程加快，我國AD的發病率逐年升高，嚴重威脅中老年人的健康，給社會、家庭造成了沉重的負擔。目前美國FDA批準上市的抗AD藥物主要是N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體阻滯劑和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)抑制劑，雖可適度改善患者的癥狀，但仍不能根治、逆轉AD的發展。中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑的協同作用特點，在改善AD患者認知功能、提高日常生活能力與生活質量方面具有顯著的療效，且毒副作用小，長期服用不易耐藥[1]。

有學者將AD稱為腦內的3型“糖尿病”并指出AD的核心可能是由于腦胰島素和胰島素樣生長因子信號傳導通路障礙所引起的[2]。研究證實，糖尿病是AD的一個非常重要的高危因素，糖尿病患者并發AD的風險也非常高，且有不少AD患者同時合并糖尿病[3]，這極大增加了患者的痛苦，并給臨床治療帶來更大的難度。黃芪散源自《圣濟總錄》，是治療消渴病的經典方，由葛根、黃芪、桑白皮組成。研究發現[4]，黃芪散可降低糖尿病小鼠的空腹血糖、糖耐量，并降低腎上腺素引起的高血糖。實驗證明黃芪散可改善5×FAD小鼠的學習記憶、空間認知功能障礙和AD樣病理[5]。中藥復方具有多成分-多靶點-多途徑的協同作用特點，很難從整體到細胞再到分子水平進行系統全面地闡釋。網絡藥理學是結合計算機技術、系統生物學及生物信息學的新興學科，可整體系統地分析“藥物-靶點-通路-疾病”之間的相互關系，能從分子層面和整體的角度闡明中藥復方的藥效物質基礎和作用機制[6]，從而為中藥復方有效成分的篩選和作用機制的研究提供技術支撐，且與中醫治病整體原則及中藥復方多成分、多靶點、多通路徑協同作用特點高度契合。

黃芪散有效成分眾多，作用靶點豐富，但黃芪散治療AD的有效成分及作用機制尚不明確。因此，本研究采用網絡藥理學的方法，對黃芪散的有效成分、靶點、信號通路進行預測及分析，并借助細胞試驗加以驗證，試圖在分子水平探究黃芪散治療AD的作用機制，以期為深入開展黃芪散基礎實驗研究以及臨床合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃芪散有效成分及靶點的篩選

從TCMSP 數據庫(http ://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選黃芪散(葛根、黃芪、桑白皮)中各味中藥的化學成分，根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug likeness，DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對應靶點，將OB≥30%及DL≥0.18設為篩選條件，并根據文獻檢索補充黃芪散中有明確治療AD藥理活性的有效成分，將檢索所得各個主要成分于TCMSP數據庫、ETCM數據庫中篩選相關靶點。采用Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)將獲得的黃芪散有效成分對應的靶蛋白名轉換為標準基因靶點名稱。

1.2 AD疾病相關基因檢索

以“阿爾茨海默病”的英文“Alzheimer′s disease”為關鍵詞在DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/)和GeneCards數據庫(https://genealacart.genecards.org/)中篩選AD相關的基因，在DisGeNET數據庫中以得分>0.1作為篩選條件選擇相關基因，在GeneCards數據庫則選擇相關性分數(relevance score≥30)的基因，并對檢索到的靶點進行處理，之后將兩個數據庫合并去重從而獲得最終AD的相關靶點。

1.3 PPI網絡構建

將黃芪散的有效成分與AD作用靶點上傳OmicShare平臺(https://www.omicshare.com/)進行配對，得到疾病靶點與有效成分交集的靶點，再將這些交集靶點導入到STRING數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”進行操作，最小相互作用閥值設為“medium confidence=0.4”，得到PPI網絡。

1.4 關鍵靶點的篩選

將候選作用靶點PPI文件中的node1、node2、combined score上傳至Cytoscape 3.7.1軟件進行PPI網絡的可視化處理，并使用工具中的 Network Analysis進行網絡拓撲分析，主要根據結果中的degree值的大小篩選，獲得關鍵靶點。

1.5 GO和KEGG分析

用R語言軟件及Bioconductor插件，導入Venn圖共同靶點，使用cluster Profiler等處理數據，取P<0.05標準，以涉及的靶點數目多少進行排序，選擇排名前20的進行可視化展示，運行R語言得到GO和KEGG富集分析的氣泡圖。

1.6 網絡構建

將黃芪散有效成分、對應靶點導入Cytoscape 3.7.1構建黃芪散有效成分-靶點網絡。

1.7 體外驗證實驗

1.7.1 細胞與試劑

大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞(長沙贏潤生物技術有限公司，批號2015032007)；Aβ25-35(美國Sigma公司，批號053M4804V)；多奈哌齊(衛材藥業有限公司，批號 190804)；ELISA測定試劑盒(武漢塞培生物科技有限公司，批號20190213)；ROS試劑盒(碧云天生物，批號041720200803)；PINK1抗體、parkin 抗體、p62抗體、腦源性神經生長因子(BDNF)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G(Ig G)、HRP標記的山羊抗兔Ig G(美國Proteintech公司，批號分別為00047643、00091761、00098963、00047316、SA00001-1、SA00001-2)；LC3Ⅱ/Ⅰ抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號11)；NLRP3抗體(Abclonal，批號3561487002)；DMEM細胞培養液(默飛世爾生物化學制品有限公司，批號SH3002201)；10%新生小牛血清(Hyclone Lab，批號220118612)。黃芪散購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，取1劑，置于圓底燒瓶中，混勻，加入10倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，收集藥液，用4～6層紗布過濾，收集濾液，倒入容器。剩余藥渣再加入8倍量水，煎煮2次，每次各20 min，過濾，收集濾液。合并3次濾液，濃縮至生藥含量質量濃度為1.0 g/mL的黃芪散水煎劑，冷凍干燥成凍干粉，保存備用。

1.7.2 MTT法檢測細胞存活率

采用對數生長期的PC12細胞進行試驗，分為4組。對照組(加入不含FBS、PBS的DMEM培養基孵育48 h)、模型組(加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35[7]孵育48 h)、多奈哌齊組(20 μmol/L Aβ25-35+15 μmol/L鹽酸多奈哌齊)及黃芪散治療組(細胞模型+黃芪散處理組)。黃芪散組分別加入10、20、40、80、160、320 mg/L黃芪散繼續培養48 h，采用MTT法用酶標儀在570 nm波長處檢測每個孔PC12細胞的吸光度值，計算細胞活率。

1.7.3 用顯微鏡觀察各組的細胞形態學和突起長度

取對數生長期的PC12細胞培養24 h后在培養基中加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35，顯微鏡下觀察處理后各組PC12細胞形態和統計細胞突起的長度。

1.7.4 透射電鏡觀察PC12細胞自噬小體

PC12細胞以1×106接種于6孔板中，按照“1.7.2”項分組方法處理24 h后，棄掉培養液，PBS浸洗細胞3次，用0.25%胰酶消化后收集細胞懸于PBS中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入3%透射電鏡專用戊二醛于4 ℃過夜避光固定PC12細胞4 h，透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.7.5 ELISA檢測PC12細胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α含量

PC12細胞以1×107接種于96孔板中，100 μL/孔，當80%融合時，分別給予各組處理因素，每組3個復孔。按實驗要求處理完成后，收集上清液留作待測標本。采用ELISA測定進行檢測，按照ELISA測定試劑盒的說明進行操作。

1.7.6 黃芪散對Aβ25-35誘導的PC12細胞ROS含量的影響

PC12細胞按照“1.7.2”項方法經藥物作用48 h后，3 000 r/min在4 ℃條件下離心10 min 后，取上清，按照試劑盒操作測定ROS含量。

1.7.7 Western blot法檢測相關蛋白表達

PC12 細胞按照“1.7.2”項方法經藥物處理48 h后，提取各組細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，將蛋白質轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST封閉。分別加入PINK1、parkin、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ、NLRP3、BDNF一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌膜后加HRP標記的二抗，避光室溫孵育1～2 h，采用ECL法檢測目的條帶，膠片曝光，顯影，以β-actin為內參，分析結果。

1.7.8 統計學處理

2 結果

2.1 黃芪散有效成分的篩選和靶點預測

從TCMSP中以OB≥30%，DL≥0.18為條件，對黃芪散的有效成分進行篩選，結合文獻查閱結果[8-10]，補充納入有較好治療AD藥理活性成分的黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)、葛根素(puerarin)、白藜蘆醇(resveratrol)。最終篩選出44個有效成分(見表1)。其中黃芪12個，葛根5個，桑白皮32個，重復成分5個。

表1 黃芪散有效成分Table 1 Effective ingredients of Huangqisan

續表1(Continued Tab.1)

2.2 “有效成分-靶點”網絡構建

利用Perl軟件整理數據，導入Cytoscape 3.7.1軟件，構建黃芪散及AD的有效成分-靶點網絡圖(見圖1)。利用Cyto Hubb插件得出排名前4位的核心有效成分為槲皮素、葛根素、黃芪甲苷和白藜蘆醇。

圖1 黃芪散有效成分-靶點網絡Fig.1 Effective ingredients of Huangqisan-target network注：紅色菱形表示黃芪散的有效成分；藍色長方形：靶基因。Note:Red diamond:Huangqisan compound;Blue rectangle:Target gene.

2.3 AD相關基因

在DisGeNET和GeneCards數據庫AD的靶基因，共得到2 894個基因。

2.4 PPI網絡構建圖

將黃芪散-AD交集靶點導入String網站，獲得PPI圖(見圖2)，其中節點數102、邊數1 124、平均節點度8.46、平均局部聚類系數0.588；網絡節點代表蛋白質，連線代表蛋白質之間的相互作用。鄰接節點個數越多，成為關鍵基因的概率越大。其中排名前10的基因為PINK1、NLRP3、BDNF、INSR、MTOR、OPTN、APP、CASP3、SOD2、GSK3B。

圖2 靶蛋白PPI網絡圖Fig.2 PPI network diagram of target protein

2.5 GO和KEGG結果

GO富集分析包括細胞成分、分子功能和生物過程3部分。將GO富集排名前20位制成氣泡圖(見圖3)，富集的GO功能主要包括自噬、炎癥反應、對突觸可塑性的調節、對胰島素的反應、神經元凋亡過程、氧化應激反應等。行KEGG通路富集分析制成氣泡圖(見圖4)。富集的KEGG通路主要包括線粒體自噬信號通路、胰島素抵抗、自噬、胰島素信號通路、阿爾茨海默病等。

圖3 GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis

圖4 KEGG通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis

2.6 黃芪散對Aβ25-35誘導的PC12細胞存活率的影響

與空白組比較，模型組PC12細胞活率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪散組作用后，細胞活率顯著升高(P<0.05，P<0.01)。黃芪散各給藥組(10～80 mg/L)與模型組比較，細胞存活率均明顯升高。結果顯示黃芪散在80 mg/L具有統計學差異，且之后隨著濃度的升高其存活率增加幅度不明顯，因此后續研究中采用黃芪散80 mg/L進行給藥(見表2)。

表2 黃芪散對Aβ25-35損傷 PC12細胞活率的影響Table 2 Effects of Huangqisan on the viability of PC12 cells injured by

2.7 各組PC12細胞形態學和突起長度的改變

與對照組相比，模型組的細胞數量顯著減少，且模型組細胞的突起明顯縮短甚至消失，外緣形狀變成鈍圓形，提示AD細胞模型構建成功。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的細胞細胞數量明顯增加，形狀為不規則多邊形，與對照組的細胞形態相似(見圖5)。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PC12細胞突起長度明顯增加(P<0.05，P<0.01)(見表3)。

表3 各組PC12細胞突起生長的比較Table 3 Comparison of synaptic growth of PC12 cells in each group

圖5 各組PC12細胞的形態(×800)Fig.5 The morphology of PC12 cells in each group (×800)注：A：對照組；B：模型組；C：多奈哌齊組；D：黃芪散組，下同。Note:A:Control group;B:Model group;C:Donepezil group;D:Huangqisan group,the same below.

2.8 黃芪散對Aβ25-35誘導的PC12細胞自噬小體的影響

對照組PC12細胞內可明顯觀察到完整形態線粒體，同時整體細胞形態完整。與對照組比較，模型組細胞經Aβ25-35損傷后沒有出現典型的自噬小體，并且線粒體呈現空腔化改變，細胞整體形態發生變化。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PC12細胞自噬小體顯著增加，同時可觀察到較多被自噬小體包裹的受損線粒體，提示黃芪散可顯著激活PC12細胞的自噬(見圖6)。

圖6 透射電鏡檢測各組細胞自噬小體(×30 000)Fig.6 Transmission electron microscope for observing autophagosomes in all groups(×30 000)

2.9 各組PC12細胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α水平

與對照組比較，模型組PC12細胞IL-1β、IL-18和TNF-α水平均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組PC12細胞的IL-1β、IL-18和TNF-α水平顯著減低(P<0.05，P<0.01)，提示黃芪散對PC12細胞的炎癥反應具有明顯的抑制作用(見表4)。

表4 各組PC12細胞IL-1β、IL-18和TNF-α水平的比較Table 4 Comparison of the levels of IL-1β,IL-18 and TNF-α in the supernatant of PC12 cells in each

2.10 黃芪散對Aβ25-35誘導的PC12細胞ROS含量的影響

與對照組相比，模型組PC12細胞ROS含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PC12細胞ROS含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)(見表5)。

表5 黃芪散對ROS含量的影響Table 5 Effect of Huangqisan on contents of

2.11 黃芪散對Aβ25-35誘導的PC12細胞中自噬相關蛋白及NLRP3、BDNF蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞PINK1、parkin、BDNF蛋白表達顯著降低，p62、LC3Ⅱ/Ⅰ、NLRP3蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PINK1、parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、BDNF蛋白表達顯著升高，p62、NLRP3蛋白表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見圖7)。

圖7 黃芪散對Aβ25-35誘導PC12細胞自噬相關蛋白及NLRP3、BDNF蛋白表達的影響Fig.7 Effect of Huangqisan on the proteins expression of autophagy-related proteins and NLRP3,BDNF in Aβ25-35-induced PC12 cells

3 討論與結論

AD因其具有和1、2型糖尿病相似的發病機制，即主要體現在腦胰島素缺乏和胰島素抵抗，已被學術界稱為“3型糖尿病”。糖尿病屬于中醫學的消渴，以氣陰兩虛、燥熱內盛為主，發展至后期則氣陰兩傷，陰陽俱虛，變證百出。因此，益氣、養陰、清熱是治療消渴病的基本法則。黃芪散是治療消渴的經典方，方中葛根生津止渴升脾中清陽，輸津液以溉五臟而滋陰清熱；黃芪有補氣健脾，取其氣復津還，云行而雨施之意；桑白皮甘寒瀉火，滋陰潤燥，且其甘寒之性以制黃芪稍熱之性；三藥配伍，共奏益氣健脾，養陰清熱，生津止渴之效，三消并治，從而起到標本兼顧之效。

有效成分-作用靶點網絡顯示黃芪散治療AD具有多成分、多靶點的特點，結果顯示槲皮素、葛根素、黃芪甲苷和白藜蘆醇是其關鍵有效成分。研究證實槲皮素可通過經典的雌激素受體通路及MAPK途徑增加Bcl-2/Bax表達比值及下降Caspase-3蛋白表達，從而減弱凋亡發生[11]。研究證明葛根素可有效減緩AD模型大鼠嗅球內tau蛋白磷酸化水平的增加，其作用機制可能與其降低GSK-3β活性水平有關[12]。研究證明基于MEK5 /ERK5信號通路對AD大鼠小膠質細胞的活性具有抑制作用，可拮抗AD大鼠神經細胞的凋亡[13]。研究發現[14]，白藜蘆醇可能通過促使海馬小膠質細胞M2型極化進而減輕炎性損傷改善AD小鼠的認知功能障礙。

將有效成分和AD共同靶點相映射，得到藥物-疾病共同作用靶點102個。黃芪散關鍵靶點居前三位的是PINK1、NLRP3、BDNF。PINK1是PINK1/parkin信號通路的主要成員，研究發現[15]，激活PINK1-Parkin介導的線粒體自噬而影響AD病理，改善AD模型小鼠的認知和記憶障礙功能。研究表明[16]，NLRP3炎癥小體可能通過調節炎癥反應在AD發生發展中扮演十分重要的角色，NLRP3炎癥小體激活的兩個關鍵標志物IL-1β和IL-18在AD患者腦內處于高水平狀態。BDNF作為一個重要的神經細胞營養因子，在突觸可塑性、神經發生和神經細胞存活中發揮關鍵作用[17]。

GO富集分析顯示黃芪散治療AD的基因功能主要體現在自噬、炎癥反應、對突觸可塑性的調節、對胰島素的反應、神經元凋亡過程、氧化應激反應等過程。在本研究篩選出的信號通路中，與黃芪散有效靶點的關聯度最高的是線粒體自噬信號通路，其次是胰島素抵抗。在本研究中，結合 AD的發病機制，篩選出預測結果中的線粒體自噬、炎癥反應、突觸可塑性的調控機制為黃芪散對AD干預的可能機制開展體外細胞實驗。PINK1/parkin信號通路是調控線粒體自噬的關鍵通路，其作用方式為通過泛素化parkin以激活自噬[18]。PINK1為線粒體受損的主要探測器，當線粒體受損時，PINK1在線粒體外膜磷酸化parkin將其從細胞質內募集至受損線粒體，進而磷酸化胞漿中的E3泛素蛋白連接酶parkin誘導其從細胞質內向受損的線粒體外膜上募集，活化的parkin將泛素連接到底物蛋白上形成泛素鏈，與p62等結合以募集胞質中的自噬標志物LC3，形成具有雙層膜結構的自噬小體[19]。自噬小體最后通過融合溶酶體將受損的線粒體完全降解，完成線粒體自噬的過程。LC3-Ⅱ的轉化的程度越高，自噬小體數量就越多，自噬水平可以通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ判斷[20]。p62能直接與LC3蛋白特定區域結合，并最終被自噬溶酶體選擇性降解，自噬發生時p62蛋白在自噬小體內被降解[21]，因此p62蛋白的降解也是反映自噬水平的標志之一。研究顯示[22]，線粒體自噬受損可能會引起Aβ和tau蛋白的積累，加劇氧化損傷，導致突觸功能障礙和認知障礙。因此，線粒體自噬對AD具有十分重要的作用。研究證實通過激活PINK1/parkin通路促進線粒體自噬可改善AD模型小鼠的認知功能障礙、增強線粒體的功能、起到神經元保護的作用[23]。本研究結果表明黃芪散能增加自噬小體數量，促進自噬小體包裹受損線粒體，升高LC3Ⅱ/Ⅰ比值，上調PINK1、parkin蛋白表達，下調p62蛋白表達，提示黃芪散可能通過激活PINK1/parkin 通路促進線粒體自噬水平。研究表明[24]，ROS是促進NLRP3小體活化及其下游IL-1β、IL-18和TNF-α等炎癥分子的表達的關鍵信號。實驗證實通過激活PINK1/parkin通路促進線粒體自噬可降低ROS水平，抑制NLRP3炎癥小體活性，減少下游的IL-1β、IL-18等炎癥因子水平，在AD中發揮保護作用[25]。本研究結果表明黃芪散能顯著降低ROS水平，抑制NLRP3炎癥小體活性，并降低炎癥因子IL-1β、IL-18和TNF-α水平，可能與黃芪散激活PINK1/parkin通路促進線粒體自噬水平有關。神經元是神經系統的結構單元，神經系統中神經元之間通過突觸緊密聯系。神經元中的神經突向外生長是神經退行性和神經保護的標志[26]。神經突起生長是神經元發育，突觸形成和神經再生的重要前提。所以促進神經突起的生長和神經細胞損傷后的修復在中樞神經系統疾病中的治療顯得尤為重要。BDNF作為一個重要的神經細胞營養因子，在突觸可塑性、神經發生和神經細胞存活中發揮關鍵作用[17]。研究證明激活PINK1/parkin通路促進線粒體自噬可改善3xTg-AD小鼠學習記憶認知障礙和突觸、樹突棘結構及功能損傷[27]。在我們的研究中，發現黃芪散可升高Aβ25-35誘導的PC12細胞的存活率、增加細胞突起長度、提高BDNF蛋白表達，可能與黃芪散激活PINK1/parkin通路促進線粒體自噬有關。

綜上，本研究運用網絡藥理學和實驗驗證的方法分析了黃芪散治療AD的作用機制，得出的結論是：黃芪散可能是通過激活PINK1/parkin通路促進線粒體自噬清除ROS進而抑制NLRP3炎癥小體的活化和改善突觸可塑性而發揮治療AD作用。從分子、細胞水平進行闡述，為深入開展黃芪散基礎實驗研究以及臨床合理應用提了供參考。