土家藥三顆針對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群的影響

胡雪黎，田 力，李 鴻,，涂 星，聶 娟,，楊 寶2,,，劉可云，胡澤華,*

1湖北民族大學生物資源保護與利用湖北省重點實驗室；2湖北民族大學風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室；3湖北民族大學醫學部；4湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心，恩施 445000

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性的炎癥性疾病，臨床主要表現為腹痛、腹瀉、粘液膿血便等[1]。潰瘍性結腸炎的中醫證型主要分為大腸濕熱、肝郁脾虛、陰虛腸燥、脾胃虛弱、脾腎陽虛、血瘀腸絡、寒熱錯雜等，各醫家多遵循“因證立法、循法遣方”的治療原則，多選用清熱、利濕、益氣、健脾之品來治療[2]。三顆針(Berberidis Radix)為小檗科植物蠔豬刺BerberisjulianaeSchneid、小黃連刺BerberiswilsonaeHemsl、細葉小檗BerberispoiretiiSchneid或匙葉小檗BerberisvernaeSchneid等同屬數種植物的干燥根[3]，性寒、味苦，歸肝、胃、大腸經，具有敗火燥濕、清熱解毒的功效[4]，是恩施土家族苗族自治州道地藥材。土家醫常單用三顆針或與映山紅根、石榴皮、吳茱萸等配伍治療泄瀉、痢疾，療效顯著，但其具體作用機制尚未明確。

腸道菌群數量龐大、種類繁多，在宿主的免疫應答、新陳代謝及疾病進程中扮演著重要角色[5]。腸道菌群參與了腸黏膜屏障、物質吸收、代謝與營養等功能，同時介導T淋巴細胞的增殖與分化，調節腸道免疫應答[6]。大量研究表明，腸道菌群的失調與潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征及結直腸癌息息相關[7-9]。目前常采用氨基水楊酸類藥物、類固醇類藥物、免疫抑制劑或手術來治療潰瘍性結腸炎，療效一般且易反復[1]。近年來，相關文獻[10-13]報道了中醫藥通過調節腸道菌群結構、恢復菌群多樣性治療潰瘍性結腸炎，且效果確切。基于此，我們擬考察三顆針對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群的影響，以期從腸道菌群介導的角度初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

60 只SPF級c57BL/6J小鼠，19～21 g，8 周齡，雌雄各半，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SCXK(遼)2020-0001。飼養于溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%的清潔級動物房中，光暗周期12 h。本實驗經湖北民族大學醫學倫理委員會批準[(2021)第46號]。

1.2 藥物與試劑

右旋葡聚糖硫酸鈉(批號116570400，美國MP公司)；美沙拉嗪腸溶片(批號210728，葵花藥業佳木斯鹿靈制藥有限公司)；糞便隱血試劑盒(批號C027-1-1，南京建成生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(批號20210506，飛凈生物科技有限公司)；Mag Pure Soil DNA LQ Kit試劑盒(批號D6356-02，Magen公司)；1×ds DNA HS Assay Kit for Qubit試劑盒(批號12642ES76，上海翌圣(Yeasen)生物科技有限公司)；Takara Ex Taq試劑盒(批號RR001Q，Takara公司)；其余試劑均為分析純。

三顆針藥材采自湖北建始，經湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心涂星博士鑒定為蠔豬刺BerberisjulianaeSchneid根。取三顆針藥材粉碎，加入10倍量70%乙醇浸泡12 h后加熱回流提取2 次，共3 h。將兩次濾液合并后濃縮成浸膏(出膏率為14.35%，1 g浸膏≈6.67 g生藥)，4 ℃保存備用。

1.3 儀器

RE-2000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；BSA224S-CW分析天平(德國賽多利斯公司)；5810R高速冷凍離心機(德國艾本德公司)；TC-120組織自動脫水機、TB-718E組織包埋機、R139輪轉式切片機、TK-218II攤片機(泰維科技實業公司)；顯微鏡(Nikon公司)；KBF240電熱恒溫培養箱(德國賓得公司)；MY-20組織勻漿機(上海凈信公司)；580BR10905 PCR儀(Bio-rad公司)；SN 002358 QIAxtractor高通量測序儀(QIAGEN公司)；2500凝膠成像儀、HE-120電泳儀(Tanno公司)。

1.4 造模、分組及給藥

小鼠適應性喂養7 d后隨機分為正常對照組(normal，N)、模型組(model，M)、美沙拉嗪組(mesalazine，ME)、三顆針低劑量組(BJ-L)、三顆針中劑量組(BJ-M)、三顆針高劑量組(BJ-H)(n=10)。正常對照組每天飲用蒸餾水，其余組每天自由飲用2.5% DSS溶液，連續7 d誘導潰瘍性結腸炎模型。

根據《中國藥典》2020版[3]中三顆針劑量15 g經體表面積等效劑量換算得到2.28 g/(kg·d)，以該劑量作中劑量，1/2作低劑量，2倍作高劑量。精密稱量三顆針浸膏分散于蒸餾水中，分別配制成濃度為8.5、17.0、34.0 mg/mL的混懸液，混勻后置于4 ℃保存備用；將美沙拉嗪腸溶片去除包衣，用研缽研成粉末，精密稱取美沙拉嗪粉末分散于蒸餾水中，根據200 mg/kg劑量配制成濃度為10 mg/mL的混懸液并定容，混勻后置于4 ℃保存備用。

從造模的第1 d起，美沙拉嗪組和三顆針組按照0.2 mL/10 g的灌胃體積灌胃；正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水。連續灌胃10 d。每日記錄體質量、精神活動狀態、毛發光澤、大便性狀和便血情況，根據Cooper評分改良法[14]進行疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分。末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，處死后迅速取出結腸，記錄長度并拍照，取肛門前2～3 cm處(約1 cm)結腸采用4%多聚甲醛固定。

1.5 蘇木精-伊紅染色及組織病理學分析

將固定好的組織經過修整、脫水、浸蠟、包埋、切片、染色及封片后，在顯微鏡下觀察并拍攝記錄。

1.6 腸道菌群測序

根據藥效學分析三顆針高劑量組療效最佳，因此選用三顆針高劑量組腸道菌群測序。取各組小鼠盲腸內容物，參照試劑盒說明書提取和純化腸道菌群總DNA，根據16S rRNA編碼基因V3-V4目標序列進行PCR擴增，V3-V4前端引物為343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′，后端引物為798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′。PCR擴增程序為94 °C預變性4 min；94 °C預變性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸20 s，共26 次循環；然后于72 °C復性5 min，擴增產物于4 °C條件下保存。

1.7 生信學分析

基于Illumina高通量測序平臺獲得原始數據，然后對原始數據進行處理及質控后得到較為優質的序列，對優質序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OUT)分類并挑選豐度最強的序列作為該OTU的代表序列，最后進行物種注釋、群落結構、Alpha多樣性、Beta多樣性、線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)等生信學分析。

1.8 基于PICRUSt的功能預測

使用PICRUSt2軟件將基于Greengenes數據庫注釋的測序數據進行數量標準化，并與COG數據庫、KEGG數據庫進行對比，預測已知微生物基因功能構成，統計不同樣本和分組之間在功能上的差異。

1.9 統計學分析

采用SPSS 24.0分析數據，兩組之間采用T-test、Wilcoxon test分析，三組及以上采用ANOVA、Kruskal Wallis分析，使用GraphPad Prism 8軟件及R軟件包作圖。

2 結果

2.1 三顆針對體重、DAI評分及結腸長度的影響

正常組小鼠活動敏捷、毛發光亮、進食正常、體重呈上升趨勢；與正常組相比，模型組小鼠精神懈怠、少食懶動，出現稀便、便血等癥狀，體重顯著降低(P<0.05)，DAI評分顯著升高(P<0.05)，表明成功建立了UC模型。如圖1A、1B所示，經美沙拉嗪和三顆針干預后，小鼠體重顯著升高(P<0.05)，DAI評分顯著降低(P<0.05)。如圖1C所示，與正常組相比，UC小鼠結腸長度顯著縮短(P<0.05)；與模型組相比，美沙拉嗪組及三顆針中、高劑量組結腸長度明顯趨向于正常組(P<0.05)，綜合提示三顆針能夠顯著改善UC小鼠的疾病狀態。

圖1 三顆針對小鼠體重變化(A)、DAI評分(B)、結腸長度(C)的影響(n=10)Fig.1 The effect of BJ on the weight of mice (A),DAI score (B),colon length(C) (n=10)注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。Note:Compared with N,#P< 0.05;Compared with M, *P<0.05.

2.2 三顆針對潰瘍性結腸炎小鼠組織病理學的影響

如圖2所示，正常組小鼠腸黏膜結構完整，杯狀細胞正常分化。模型組小鼠結腸組織結構基本消失，黏膜層可見充血、水腫，炎性細胞彌漫性浸潤，杯狀細胞可見明顯變形、減少。與模型組相比，美沙拉嗪組和三顆針中、高劑量組結構均較為完整，炎性細胞浸潤較少，杯狀細胞結構比較完整。

綜上所述，茵梔黃口服液聯合培菲康治療新生兒黃疸的療效非常好，優于單獨用藥，能夠降低患兒血清白蛋白水平和非結合膽紅素水平，臨床中可以推廣使用。

圖2 組織病理切片 HE 染色圖(400 ×)Fig.2 Pathological sections of tissues HE staining (400×)

2.3 三顆針對小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 腸道菌群的物種注釋

如圖3C所示，本實驗共得到1 447個OTUs，組間共有OTUs為226個。其中正常組獨有374個OTUs，模型組獨有284個OTUs，三顆針給藥組獨有259個OTUs，提示各組腸道菌群結構在整體相似的基礎上存在一定的差異。經鑒定，1 447個OTUs分別屬于14個門和166個屬。

2.3.2 Alpha多樣性分析

如圖3A、3B所示，隨著測序深度和樣本量的增加，曲線趨于平緩，表明本次實驗樣本測序深度和樣本量足夠。經DSS誘導后，Shannon指數和Simpson指數顯著下降(P<0.05)，提示UC小鼠腸道菌群物種均勻度和豐富度下調，經三顆針干預后，Shannon指數和Simpson指數升高(P>0.05)，差異無統計學意義，表明三顆針可以改善腸道菌群多樣性。

2.3.3 Beta多樣性分析

Pcoa分析(圖3D)中第一主成分和第二主成分對模型的解釋率分別為33.98%和20.18%，提示該模型的解釋能力和預測能力較好。模型組在Pcoa分析中距離正常組較遠，說明模型組小鼠腸道菌群結構較正常組發生了顯著變化。三顆針給藥組則向正常組靠近，且遠離模型組，表明三顆針給藥后，小鼠腸道菌群結構逐漸向正常組恢復。其次在聚類分析(圖3E)中，各組樣本可以聚類到一起，說明本次實驗中同組樣本間的差異較小。

圖3 樣品序數(A)、OUT序列(B)、韋恩圖(C)、Pcoa分析(D)及聚類分析(E)Fig.3 Number of sample sequenced(A),OUT Rank(B),veen plot(C),Pcoa analysis(D) and UPGMA analysis(E)

2.3.4 腸道菌群結構分析

如圖4A所示，各組小鼠腸道菌群在門水平主要由擬桿菌門、厚壁菌門、彎曲桿菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門、變形菌門、脫硫菌門等構成，占比達到99.00%。與正常組相比，模型組厚壁菌門和脫硫菌門相對豐度顯著上調(P<0.05)，彎曲菌門豐度顯著下調(P<0.05)，擬桿菌門、放線菌門、變形菌門相對豐度下調，但差異無統計學意義；與模型組相比，三顆針組彎曲桿菌門相對豐度顯著上調(P<0.05)，厚壁菌門相對豐度顯著下調(P<0.05)，脫硫菌門相對豐度下調，擬桿菌門和變形菌門相對豐度上調，差異無統計學意義。提示三顆針在門水平能夠顯著恢復小鼠腸道菌群結構。

如圖4B、4C所示，小鼠腸道菌群在屬水平上主要由螺桿菌屬、Muribaculaceae屬、擬桿菌屬、毛螺旋菌屬NK4A136_group、Mucispirillum屬、普雷沃氏菌屬UCG-001、另枝菌屬、Parabacteroides屬、Odoribacter屬組成。與正常組相比，模型組螺桿菌屬、Muribaculaceae屬、理研菌屬相對豐度顯著下調(P<0.05)，Odoribacter屬相對豐度顯著上調(P<0.05)。與模型組相比，三顆針組螺桿菌屬相對豐度顯著上調(P<0.05)，Odoribacter、另枝菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group相對豐度顯著下調(P<0.05)。提示在屬水平上，三顆針干預潰瘍性結腸炎可能與回調螺桿菌屬、Odoribacter等菌屬的相對豐度有關。

圖4 三顆針對門(A)和屬(B、C)水平小鼠腸道菌群結構的影響Fig.4 The effects of BJ on the relative abundance of murine gut microbiota at phylum (A) and genus(B,C) level注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。Note:Compared with N,#P< 0.05;Compared with M, *P<0.05

2.3.5 LEfSe分析

如圖5所示，本實驗展示了LDA得分大于2的差異物種。如圖5A、5C所示，與模型組相比，正常組的優勢菌種包括Muribaculaceae科、Muribaculaceae屬、螺桿菌屬、螺桿菌科、彎曲桿菌目、彎曲桿菌綱、彎曲桿菌門、毛螺菌屬_UCG_001、Tyzzerella屬、鞘脂單胞菌屬、腸桿菌屬、理研菌屬、Alloprevotella屬、鏈霉菌A2屬、羅氏菌屬、Marvinbryantia屬、支原體屬、支原體科、支原體目、Anaerotruncus、乳酸桿菌科、乳酸桿菌目、乳酸桿菌屬(P<0.05)。模型組的優勢菌種包括瘤胃球菌屬、Harryflintia屬、GCA_900066575屬、厭氧原體屬、無膽甾原體目、無膽甾原體科、醋酸菌屬、Oscillibacte屬、螺旋藻屬、Colidextribacter屬、惰性真桿菌屬、UBA1819、顫螺旋菌科、擬桿菌屬、擬桿菌科、Odoribacter屬、Marinifilaceae科、顫螺菌綱、脫硫弧菌目、脫硫桿菌屬、脫硫弧菌科、脫硫弧菌綱、毛螺菌科、毛螺菌屬、厚壁菌屬、梭菌綱(P<0.05)。如圖5B、5D所示，與模型組相比，三顆針組的優勢菌種包括丹毒絲菌目、乳酸桿菌科、乳酸桿菌屬、乳酸桿菌目、Erysipelatoclostridiaceae科、Erysipelatoclostridium屬、布勞特氏菌屬、Sutterellaceae科、副沙門氏菌屬、脫硫弧菌屬、羅氏菌屬、Clostridium_innocuum_ group無害芽孢梭菌屬、Alloprevotella屬、擬桿菌屬、擬桿菌科、螺桿菌屬、螺桿菌科、彎曲桿菌目、彎曲桿菌屬、彎曲桿菌綱(P<0.05)。綜上所述，三顆針組和正常組的優勢菌種在組成上相似，說明三顆針可以改變腸道菌群結構的組成，并抑制某些細菌的增殖。

圖5 不同組別腸道菌群的LEfSe分析圖Fig.5 LEfSe analysis of gut microbiota community of different groups

2.4 基因功能預測分析

如圖6所示，基于KEGG數據庫三級功能層，與正常組相比，模型組ABC轉運蛋白、群體感應、嘧啶代謝、糖酵解/糖異生、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、同源重組、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、肽聚糖的生物合成、淀粉和蔗糖代謝等基因功能上調(P<0.05)，大部分屬于KEGG中L1水平的代謝功能，推測當小鼠出現腹瀉、便血等潰瘍性結腸炎癥狀時，消化吸收功能出現障礙，無法提供小鼠日常活動所需能量，機體需通過更多的其他代謝補償。醚脂質代謝、亞油酸代謝、黃酮和黃酮醇的合成、異黃酮的生物合成功能則顯著下調(P<0.05)。三顆針干預后，上述基因功能均逐漸恢復至正常水平(P<0.05)，提示調節與腸道菌群代謝相關的基因功能可能是三顆針干預潰瘍性結腸炎的途徑之一。

圖6 基于三級功能層的PICRUSt 功能預測分析Fig.6 PICRUSt functional prediction analysis based on hierarchy level 3

3 討論與結論

本實驗首先從小鼠體重變化、DAI評分、結腸長度與組織形態方面驗證了三顆針對UC小鼠的干預作用，其次考察了三顆針對UC小鼠腸道菌群的影響。結果顯示，三顆針顯著改善小鼠體重、DAI評分及結腸長度，減少炎性浸潤，修復腸黏膜損傷。測序結果顯示，三顆針能夠顯著恢復DSS誘導下紊亂的菌群結構，提示三顆針對UC的干預作用可能與腸道菌群高度相關。在對正常組、模型組、三顆針組腸道菌群的Pcoa和聚類分析中發現，模型組的腸道菌群結構與正常組小鼠存在顯著差異，而經過三顆針干預后，其腸道菌群被顯著改變并接近正常組，這在群落結構分析和LEfSe分析中得以證實。通過基因功能預測發現，三顆針干預UC還可能與腸道菌群代謝功能相關，這為后續研究提供了新的方向。

腸道微生物群作為腸黏膜屏障中的生物屏障，對維持健康和疾病的體內平衡至關重要，是腦-腸軸的一部分[15]。腸道菌群的失調會導致有害菌大量增殖，有益菌減少，導致腸道菌群結構紊亂，多樣性減少，從而使腸黏膜損傷。有研究[16]認為由腸道菌群失調介導的腸道異常免疫炎癥反應是UC發病的重要原因之一，因此通過微生物制劑恢復腸道菌群的穩態治療UC逐漸成為新熱點。傳統中藥給藥途徑主要是口服湯劑，在生物體內勢必會與腸道菌群接觸，產生雙向的調節作用，部分中藥通過恢復腸道菌群的結構和多樣性保持腸道菌群的穩態達到治療作用[17]。現代藥理學研究表明，三顆針主要含小檗堿、巴馬汀、藥根堿、掌葉防己堿等多種生物堿類成分[18-19]。研究證明[20]小檗堿可以上調擬桿菌門豐度，下調厚壁菌門豐度，通過腸道菌群相關色氨酸代謝產物激活芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)治療DSS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎。Zhang等[21]通過高通量測序結果表明，巴馬汀通過上調擬桿菌門相對豐度，增加有益菌、減少有害菌，并通過恢復菌群多樣性、抑制色氨酸分解改善了DSS誘導的潰瘍性結腸炎。上述研究報道與本實驗的研究結果基本一致，同時在本實驗的LEfSe分析中，與模型組相比，乳酸桿菌目、乳酸桿菌屬、乳酸桿菌科為正常組和三顆針組共有的優勢菌種，且乳酸桿菌已被證明可以改善腹瀉[22]，另外乳酸桿菌可以通過抑制人結腸上皮細胞中細胞因子誘導的凋亡以及增加黏蛋白-2(MUC-2)的含量從而改善小鼠的結腸黏膜屏障功能[23]。梭菌是專性厭氧菌，分泌外毒素威脅人體健康，梭菌的增多促進腸道疾病的發生[24]。三顆針同科植物黃連可以抑制梭菌的生長，通過降低梭菌的數量來防治腸道癌癥[25]，本實驗中梭菌屬、梭菌綱、梭菌目是模型組的優勢菌種，而正常組和三顆針組均豐度較低，與文獻研究結果相對一致。