苦蕎多肽的純化、結構與體外抗氧化活性研究

馬 萌，陶 婷，馬挺軍

北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206

苦蕎麥又名烏麥、蕎子、三角麥等，屬蓼科蕎麥屬雙子葉植物，最早起源于中國，是世界上最早種植的農作物之一，也是我國特有的糧藥兼備的小宗糧食作物[1]。《本草綱目》中記載，苦蕎麥味苦、平、寒，具有降氣寬腸，續精神，行氣化瘀等作用[2]。已有研究證明從苦蕎麥籽粒及其蛋白水解得到的多肽粗提物具有多種生物活性，如降膽固醇[3]、防癌抗腫瘤[4]、預防高血脂[5]及抗氧化[6]等作用。

生物活性肽具有多種生物功能，這與其氨基酸組成和順序密切相關[7]，因此研究多肽功效的關鍵就是對多肽結構的鑒定。分離純化是研究多肽結構和功效關系的關鍵一步，常用的多肽分離純化技術主要有色譜、膜分離、電泳等，其中色譜技術應用最為普遍[8,9]。由于蛋白水解物組成復雜，所以在分離純化時常采用多種方法聯合處理以實現多肽的分離和富集[10-12]。以往研究表明[13]，苦蕎蛋白或酶水解產物具有多種生物活性，但是其生物活性機制尚不十分清晰，關于苦蕎活性肽結構解析及生物活性的研究鮮見報道。Ma等[14]從消化后的蕎麥蛋白中分離鑒定出4種抗氧化多肽(WPL、VPW、VFPW和PW)，比蕎麥蛋白質混合物清除ABTS自由基能力更強。Luo[15]采用堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白得到了苦蕎清蛋白酶解液，經過超濾分離、陰離子交換色譜、反向高效液相色譜成功分離出苦蕎活性肽組分，并得到其氨基酸序列為Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp。

本研究以苦蕎功能提取物廢渣為原料提取苦蕎粗蛋白輔以植物乳桿菌發酵法制備苦蕎多肽。得到的苦蕎多肽發酵液經過大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠、液相色譜純化后測定抗氧化活性，對篩選出抗氧化活性強的部位進行結構鑒定，探究苦蕎多肽粗提液抗氧化活性的主要來源，以期為苦蕎多肽的進一步研究和在功能食品及保健品中的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

提取黃酮、酚酸等物質后的苦蕎廢渣，由山西農業大學(山西省農業科學院)提供，經全自動凱氏定氮儀測定蛋白含量為10.7%；ABTS自由基、DPPH自由基(Sigma公司)；葡聚糖凝膠Sephadex G-15(色譜級，北京慧德易科技有限責任公司)；四肽標準品(Gly-Gly-Tyr-Arg)、三氯乙酸(TCA)(色譜純，美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶活試劑盒(南京建成生物工程研究所)；三氟乙酸(TFA)、氫氧化鈉(NaOH)(色譜純，北京化工)；五水硫酸銅、氯化鈉(分析純，北京化工)；95%乙醇(分析純，天津市福晨化學試劑廠)；堿性蛋白酶(生物試劑，酶活為200 U/mg，北京索寶來科技有限公司)；石油醚(沸程30～60 ℃，分析純，北京東方博遠科技發展有限公司)；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC 14917(中國普通微生物菌種保藏中心)；酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；S-8型大孔吸附樹脂(分析純，上海源葉生物有限公司)。

1.2 儀器與設備

UV765型紫外-可見分光光度計(上海精科儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(北農雨禾北京科技發展有限公司)；玻璃塑料層析柱(180 mm×500 mm、2 cm×40 cm，江陰市新輝層析設備有限公司)；LC-18N-50B型真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；HD-4型紫外檢測儀(青島圣瀚化工儀器設備股份公司)；BSZ-100型自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；LC-20AD型高效液相色譜儀、LCMS-8040型液相色譜質譜聯用儀(日本島津)；KQ-700E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(邦西儀器科技有限公司)；SW-CJ-1D型單人單面垂直凈化工作臺(浙江蘇凈凈化設備有限公司)；Blue Pard型生化培養箱(上海恒科技有限公司)；YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；Milli-Q型超純水儀(美國Millipore公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 苦蕎粗蛋白的制備

參考Tao[16]的實驗方法并修改，將苦蕎廢渣干燥后磨碎，過60目篩，將苦蕎渣粉按照料液比(1∶15，W/V)加入石油醚中，在室溫下攪拌24 h進行脫脂，過濾，重復脫脂操作處理兩次。

用去離子水與脫脂后的苦蕎粉按照1∶1比例混合，攪拌10 min，用5%NaOH調節pH至10，放置于46 ℃水浴鍋中。向容器中添加40 U/g堿性蛋白酶，酶解反應20 min，加熱煮沸5 min。待溫度降至常溫，9 000 r/min離心12 min，倒出上清液，調節溶液pH至中性，得到苦蕎蛋白粗提液。調節苦蕎蛋白粗提液pH值至等電點4.5，5 000 r/min，4 ℃下離心30 min,得到沉淀，沉淀物用去離子水多次沖洗后調節其pH值為7.0，-70 ℃真空冷凍干燥24 h得到苦蕎粗蛋白固體粉末。

1.3.2 苦蕎多肽粗提液的制備

采用發酵法制備苦蕎多肽發酵液，參考唐田園[17]的方法，將植物乳桿菌培養到活菌數在log7.0 CFU/mL左右，按13%(V/V)的接種量接種到自制苦蕎粗蛋白培養基中，30 ℃培養箱中發酵2 d，在100 ℃下滅酶10 min，6 000 r/min離心22 min，去除殘渣，取上清液，得到苦蕎多肽發酵液。

1.3.3 S-8型大孔吸附樹脂分離純化苦蕎活性肽

將S-8型大孔吸附樹脂置于95%乙醇溶液中浸泡20 h，雙重水清洗至沒有乙醇味。用5% HCl清洗樹脂3 h，過濾保留樹脂，洗滌沉淀至溶液為中性，用3～5倍大孔吸附樹脂體積的NaOH(體積分數6%)通柱3 h，過濾保留樹脂，洗滌沉淀至大孔吸附樹脂pH值為7左右待用。

取10 g上述處理之后的樹脂，加入適量雙重水，使大孔吸附樹脂保持濕潤的狀態，灌裝到玻璃柱中，然后用雙重水沖洗柱子1 h，調節上樣溶液(即苦蕎多肽發酵液)pH值為5，以1.5 mL/min的速度開始上樣，上樣結束后，用雙重水沖洗直至流出溶液為無色，然后使用乙醇溶液進行洗脫。

1.3.4 葡聚糖凝膠分離純化苦蕎活性肽

稱取20 g的葡聚糖凝膠Sephadex G-15，濕法灌裝凝膠柱，柱子型號：2 cm×40 cm。將經過大孔吸附樹脂部分純化后苦蕎多肽液，用雙重水溶解配制上樣液(濃度為5 mg/mL)，經過0.45 μm微孔濾膜，取濾液5 mL加入凝膠層析柱，設定洗脫速度0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm，用雙重水進行洗脫，對洗脫液進行檢測并以抗氧化活性為指標，收集合并組分。

1.3.5 液相色譜分離純化苦蕎活性肽

選取經Sephadex G-15葡聚糖凝膠分離后的抗氧化活性能力最佳的洗脫組分，采用反相液相色譜進行分離。采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A：水(0.1% TFA)，流動相B：乙腈(0.1% TFA)，進行線性洗脫，洗脫條件：乙腈(0%→75%，0～30 min)，流速0.8 mL/min，檢測波長214 nm。根據監測圖譜收集多肽并測定抗氧化活性以及鑒定多肽序列。

1.3.6 上清液中多肽含量測定、脫鹽處理

根據雙縮脲法[18]測定苦蕎多肽粗提液、大孔樹脂分離純化后、葡聚糖凝膠分離純化后、液相色譜分離純化后的上清液中苦蕎多肽含量。分別取10 mg/mL的多肽標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于潔凈的試管中，用雙重水補充至1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，震蕩混合，靜置30 min，在波長540 nm處測定吸光值。繪制標準曲線，回歸方程為y=0.056 1x-0.001 1(R2= 0.999 4)，根據標準曲線計算出多肽的含量。

用C18柱對純化后的苦蕎多肽進行脫鹽處理，先用1 mL甲醇活化色譜柱，選用雙重水為洗脫液(0.1% TFA)對色譜柱進行洗脫平衡，收集樣品后凍干，使用1 mL雙重水(0.1% TFA)再次溶解樣品之后進樣，加入1 mL雙重水(0.1% TFA)進行去雜，最后使用500 μL 80%乙腈(0.1% TFA)洗脫，收集洗脫液，凍干后待用。

1.3.7 苦蕎多肽純度測定

收集不同濃度乙醇洗脫液，按式(1)計算苦蕎多肽純度。

(1)

1.3.8 HPLC-MS/MS分析鑒定苦蕎麥活性肽分子量分布

使用質譜儀進行檢測。設置一級掃描范圍為200～2 000 Da，溫度為320 ℃，電噴霧電壓為2.0 kV，不設置目標肽段進行自動分析，利用NCBI數據庫和質譜軟件聯合分析，結合文獻報道的多肽研究，確定有效的多肽序列。

1.3.9 體外抗氧化活性的測定

1.3.9.1 清除DPPH自由基能力測定方法

參考Ma等[19]方法。樣品在3 000 r/min離心處理15 min后，取2 mL上清液于玻璃管中，添加2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，充分震蕩，在黑暗條件下靜置30 min，在波長517 nm處測其吸光度，用無水乙醇進行調零，進行三次平行實驗。按式(2)計算DPPH自由基抑制率。

(2)

式中：Ac為2 mL無水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光值；Ai為2 mL樣品加2 mL DPPH溶液的吸光值；Aj為2 mL樣品加2 mL無水乙醇的吸光值。

1.3.9.2 清除ABTS自由基測定方法

參考Marino[20]的方法并修改。取4 mL ABTS溶液，加入40 μL苦蕎多肽上清液，混勻30 s，避光處理30 min，在波長為734 nm處進行測定，重復三次平行。按式(3)計算抑制率公式。

(3)

式中：Ac為40 μL磷酸鹽緩沖液加4.0 mL ABTS溶液的吸光值；Ai為40 μL苦蕎多肽加4.0 mL ABTS溶液的吸光值；Aj為40 μL苦蕎多肽加4.0 mL磷酸鹽緩沖液的吸光值。

1.3.9.3 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的測定

參照南京建成生物公司SOD試劑盒法說明書測定苦蕎多肽液中SOD活性。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂分離純化苦蕎多肽

苦蕎多肽粗提液經過S-8型大孔吸附樹脂純化后，在上樣濃度為5 mg/mL，洗脫流速為1.5 mL/min，乙醇濃度為55%條件下，苦蕎多肽的純度由粗提液的22.18%提高到了70%。

2.2 葡聚糖凝膠分離純化苦蕎多肽

凝膠可以根據截留分子量的大小不同從而實現分離，葡聚糖凝膠由于分離條件溫和，對樣品活性影響較小并且可再生廣泛應用于活性物質的分離，尤其是蛋白和多肽[21,22]。由圖1可知，將經過大孔吸附樹脂富集、純化處理的苦蕎多肽液繼續使用Sephadex G-15進行分離純化，獲得連續的五個峰，共分離出5個分子質量大小不同的組分，分子質量小在凝膠柱中保留時間長，分子質量較大，在凝膠柱中保留時間短，五個組分均在80 min內洗脫出來，說明五個組分分子量差別不大。由于微生物發酵使苦蕎蛋白分解成為分子量大小不等的多肽化合物，還有可能存在少數苦蕎蛋白未被水解現象，故多肽分子量是連續的。

圖1 苦蕎多肽紫外吸收圖Fig.1 UV absorption of tartary buckwheat peptide

經葡聚糖凝膠分離得到的T-1、T-2、T-3、T-4、T-5各組分凍干進行SOD酶活、DPPH以及ABTS等自由基清除實驗，測定抗氧化能力。由圖2可知，在幾種抗氧化能力測定的實驗中，5個組分表現出不同的抗氧化能力。結果發現T-2部分的SOD酶活明顯高于其他4個組分(P<0.05)；DPPH自由基清除實驗中，各組分存在一定的差異(P<0.05)，清除能力依次為T-5 > T-4 > T-3 > T-2 > T-1；ABTS清除實驗中，T-3、T-4、T-5均有較高的清除能力，抗氧化能力較強。T-3組分在ABTS和DPPH自由基清除實驗中都表現出較強的抑制作用，且SOD酶活力大于T-4、T-5兩組分，因T-4、T-5組分純化獲得數量極少，綜合考慮，選取T-3組分進行之后的純化及物質鑒定。

圖2 不同組分抗氧化活性比較Fig.2 Comparison of antioxidant activity of different components 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05)

2.3 液相色譜分離純化苦蕎多肽

由圖3可知，通過液相色譜分離得到的T-3組分紫外吸收圖中，出現了一個響應值較高的物質峰，同時還伴隨著一些小雜峰，將響應值較高的組分命名為T-3-1，收集濃縮后進行物質結構鑒定。

圖3 T-3液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of T-3

2.4 質譜鑒定結果

對通過液相色譜分離得到的T-3-1組分進行物質鑒定，結果如圖4所示，從苦蕎多肽發酵液T-3-1組分中共鑒定出蛋白249種，多肽2 324條，Chen等[23]用乳酸菌發酵制備牛乳飲料中檢測到蛋白數量110種，多肽1 601條。由圖5可知，鑒定到的多肽長度大多由10 ～ 15個氨基酸組成，屬于生物活性肽的長度范圍內。

圖4 T-3-1的鑒定信息Fig.4 Identification of T-3-1

圖5 多肽長度統計圖Fig.5 Peptide length chart

大多數植物動物蛋白中分離得到抗氧化活性肽，并且多肽序列以PYY、RWY、WY、RW、PWY、VYPF等結尾或開頭的，一般都具有抗氧化活性[24]。通過對液相色譜分離得到組分T-3-1進行質譜鑒定，從圖6結果中篩選得到氨基酸序列為酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Tyr-Leu-Pro-Phe，YLPF)和苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸(Phe-Pro-Tyr，FPY)，由此可以得出以苯丙氨酸和酪氨酸結尾的小段氨基酸序列抗氧化活性較顯著，這與Xie[25]研究得到的結論一致。

圖6 二級質譜圖Fig.6 Secondary MS spectrum

2.5 不同純度苦蕎多肽抗氧化活性測定

抗氧化基團的暴露決定了抗氧化活性的大小[26,27]，由圖7可得，不同純度苦蕎多肽表現出不同的抗氧化活性，其中，苦蕎多肽粗提液中可以檢測到少量的苦蕎多肽，可能是在酶提法提取苦蕎蛋白的過程中產生，由于苦蕎蛋白和多肽的共同存在，表現出一定的抗氧化作用；相對于苦蕎多肽粗提液和發酵液，經大孔吸附樹脂純化后的苦蕎多肽液對DPPH和ABTS抑制率顯著提高，分別為95%和82%；而經過葡聚糖凝膠分離純化后的多肽組分T-3的DPPH抑制率稍有提高但幅度不大，達到了96%，其中ABTS抑制率升高到94%。

圖7 苦蕎多肽純度及抗氧化活性大小Fig.7 Purity and antioxidant of peptide at separation positions注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05).

有趣的是，通過液相色譜進一步分離純化后得到的組分T-3-1多肽純度雖然達到了98%，但是對DPPH和ABTS抑制率不再增強，反而稍有下降，抑制率分別為89%和90%，這可能是由于苦蕎蛋白自身具有抗氧化活性，當苦蕎蛋白與多肽混合物聚集在一起，表現出比更高純度苦蕎的多肽更強的抗氧化作用。

3 結論

經過Sephadex G-15葡聚糖凝膠分離純化，T-3組分的ABTS和DPPH自由基清除能力最優，清除率分別為96%、94%。經大孔吸附樹脂純化后的苦蕎多肽對DPPH和ABTS抑制作用較強，與凝膠分離純化得到的T-3組分相近，均表現出顯著的抗氧化活性。

對通過液相色譜分離得到的T-3-1組分進行物質鑒定，從T-3-1組分中共鑒定出蛋白249種，多肽2 324條，鑒定到的多肽長度大多由10 ～ 15個氨基酸組成，屬于生物活性肽的長度范圍內。由T-3-1組分質譜鑒定結果分析得到，主要抗氧化肽的氨基酸序列為苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸(Phe-Pro-Tyr，FPY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Tyr-Leu-Pro-Phe，YLPF)。

純度不同的苦蕎多肽抗氧化能力也不同，通過液相色譜進一步分離純化T-3組分后得到的組分T-3-1，苦蕎多肽純度雖然達到了98%，但是對DPPH和ABTS抑制率不再增強，反而稍有下降，抑制率分別為89%和90%。說明發酵法制備得到的苦蕎多肽可能抗氧化活性并沒有完全與多肽純度呈正相關，當純度提高到一定程度后，多肽抗氧化活性反而下降。