QuEChERS結合GC-MS/MS測定辛辣蔬菜中18種有機磷農藥

陳 華

(寧德市農產品質量安全檢驗檢測中心， 福建 寧德 352100)

有機磷農藥(organophosphorus pesticide，OPPs)指一類含磷元素的有機酯類化合物，因其具有高效、廣譜、降解快、價格低等優勢，廣泛運用于農業生產中的病蟲害防治[1]。OPPs的作用機理主要是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性，引發乙酰膽堿過度積累，進而干擾害蟲的神經傳導[2]。然而，使用不當的OPPs可通過食物鏈進入人體，擾亂人體的認知能力及神經行為，導致機體出現震顫、出汗、畸形、內分泌失調等中毒癥狀，重者可因呼吸麻痹而死亡[3-4]。雖然我國已明令禁止在果蔬上使用多種有機磷農藥，并在食品安全國家標準GB 2763-2021《食品各農藥最大殘留限量》中設置了最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)以限制農藥使用[5]，但在實際檢測中依然能檢出有機磷農藥超標[6-7]。

當前，對蔬菜中農藥殘留檢測的方法主要有氣相色譜法(Gas chromatography，GC)、氣相色譜-質譜法(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)、氣相色譜-串聯質譜法(Gas Chromatography-Mass SpectrometryGC-MS/MS)、液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等[8]。QuEChERS法是近年興起的一種樣品前處理方法，具有快速、簡單、節約、安全等特點，廣泛用于果蔬中的農藥殘留檢測[9]。辛辣蔬菜作為一類特殊蔬菜，深受廣大人群的喜愛，同時占據著較大的市場份額[10]，但在農殘檢測領域，尚未見對辛辣蔬菜有機磷農藥檢測進行系統的分析研究。本研究采用QuEChERS前處理技術，以常見的7種辛辣蔬菜為研究對象，結合GC-MS/MS法探究在不同辛辣蔬菜中快速篩查有機磷農藥殘留情況，以期為辛辣蔬菜的農藥檢測提供借鑒經驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒，樣品購于生鮮超市及農貿市場，經檢測不含試驗所研究農藥。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器 島津GCMS-TQ8040型氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(日本島津制作所)；Aglient DB-5 MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱(美國Aglient 公司)；VORTEX-5型渦旋振蕩器(海門其林貝爾公司)；Sigma 3-18KS 型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；PL602E電子天平(瑞士METTLER公司)；Organomation EVAP-111氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2.2試劑 18種有機磷農藥標準樣品(辛硫磷、滅線磷、甲拌磷、特丁硫磷、二嗪磷、氯唑磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷、甲拌磷亞砜、馬拉硫磷、甲拌磷砜、毒死蜱、對硫磷、水胺硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、三唑磷、伏殺硫磷)購于農業部環境保護科研監測所，質量濃度100 mg·L-1；乙腈、丙酮、正己烷均為色譜純，購于上海安譜公司；氯化鈉、PSA(40～63 μm)、GCB(120～400目)購于上海安譜公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品前處理 準確稱取10.0 g樣品經料理機充分攪碎后裝于50 mL離心管，加入20.0 mL的乙腈、5.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，充分震蕩混勻后超聲提取15 min，5 000 r·min-1離心3 min。離心后吸取8.0 mL上清液加入N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)100 mg、石墨化碳黑(Graphitized carbon black，GCB)10 mg、MgSO4 700 mg。渦旋振蕩1 min后5 000 r·min-1離心3 min，吸取1.0 mL上清液于10.0 mL試管，40℃氮吹至近干，加入1.0 mL丙酮與正己烷(1+1，V∶V)混合液復溶，過0. 22 μm濾膜后待 GC-MS/MS 測定。

1.3.2配制農藥標準溶液 分別取 0.4 mL的100 mg·L-1的有機磷農藥標準儲備液于 10 mL 容量瓶中，得到4 mg·L-1的中間儲備液。分別使用7種蔬菜的空白基質液配制為50、100、200、500、1 000、2 000 μg·L-1的系列標準曲線工作液，采用空白基質加標的方式，依據峰面積y對質量濃度x進行線性回歸，繪制標準曲線，得到線性回歸方程、相關系數，以信噪比≥10 計算定量限(Limit of Quantitation，LOQ)。

1.3.3色譜條件 進樣量：1 μL；載氣：氦氣；程序升溫條件：初溫50℃，保持1 min，以25℃·min-1升溫至125℃，再以10℃·min-1升溫至280℃。

1.3.4質譜條件優化 離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時間：3.0 min。采用全掃描方式尋找目標化合物中具有最強檢測訊號的離子碎片，采集具有最佳豐度的2～3個離子碎片，再進行產物離子掃描以確定最佳子離子。進一步使用島津GC-MS/MS library軟件自動優化各化合物的碰撞能(collision energy，CE)，得到多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式下各農藥化合物的目標離子、參考離子及最佳作用電壓。

1.3.5提取劑的選擇 根據待測農藥特性和提取溶劑化學性質考慮，以確定選用提取溶劑的原則。本研究涉及的樣品為辛辣蔬菜，其多含有較多水分，且有機磷殺菌劑多易溶于丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑，故分別使用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑。

1.3.6凈化劑的選擇 使用PSA、GCB作為主要凈化劑，設置2因素3水平試驗，每組進行3次平行試驗，統計各試驗組農藥項目的平均回收率。

1.3.7基質效應評價 基質效應(matrix effects，ME)評價方式采用基質匹配標準曲線的斜率與純溶劑配制標準曲線的斜率的比值來定量評價。通過以下公式計算ME：

式中：Sm和Ss分別為基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。當ME<0時表示基質抑制效應；當ME>0時，表示基質增強效應。當|ME|≤20 %為弱基質效應，20 %<|ME|≤50%為中等基質效應，|ME|>50%為強基質效應[11-12]。本研究采用0. 10 mg·L-1基質標準溶液和同等濃度的丙酮與正己烷(1+1，V∶V)混合液的峰面積進行比較，從而確定樣品基質效應的強弱。

1.3.8回收率和重復性測定 在陰性香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒樣品中，在 0.05、0.10 和 0.50 mg· kg-13個添加水平進行加標試驗，單水平設置6次重復并計算回收率和重復性。

1.3.9實際樣品檢測 在市售蔬菜中抽取21批次樣品，涵蓋香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒7種樣品，依據“1.3.1”方法處理后上機檢測。

1.4 數據處理

使用EXCEL進行數據處理及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

由圖1可知，采用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑進行樣品提取時，18種有機磷農藥的平均回收率分別為87.14%、67.76%、90.77%、86.48%，以乙腈作為提取劑時18種農藥回收率最高，故采用乙腈作為農藥提取溶劑。

圖1 不同溶劑條件下18種有機磷農藥的回收率(n=3)Fig.1 Recoveries of 18 kinds of organophosphorus pesticides under different solvent conditions (n=3)

2.2 凈化方法的優化

QuEChERS試驗中常用的分散劑有PSA、GCB和C18等，其中PSA 可用于去除碳水化合物、脂肪酸、酚類和少量色素，GCB主要用于去除色素、甾醇類和非極性干擾物，而C18 主要用于去除脂肪和酯類等非極性物質。鑒于目標樣品中油脂含量較低，故本研究主要選用PSA、GCB對溶劑進行凈化。由表1可知，各試驗組合回收率范圍介于83.40～93.42%，4號試驗組具有最高的回收率，據此可以確定PSA的最佳用量為100 mg，GCB的最佳用量為10 mg。

表1 分散劑中各組分含量Table 1 Content of each component in the dispersant

2.3 質譜條件的選擇

經優化后得到MRM模式下各農藥化合物的目標離子、參考離子及最佳作用電壓，各農藥化合物質譜參數見表2。配制濃度為100 μg·L-1的農藥標準品進樣分析，獲得農藥混標的總離子流(total ion current，TIC)圖譜，可知多種有機磷農藥經色譜柱得到初步分離，并達到較好的分離效果，見圖2。

注：A為辛硫磷；B為滅線磷；C為甲拌磷；D為特丁硫磷；E為二嗪磷；F為氯唑磷；G為甲基對硫磷；H為殺螟硫磷；I為馬拉硫磷；J為甲拌磷砜；K為毒死蜱；L為甲拌磷亞砜；M為對硫磷；N為水胺硫磷；O為甲基異柳磷；P為丙溴磷；Q為三唑磷；R為伏殺硫磷圖2 GC-MS/MS中18種農藥標準溶液TIC譜圖Fig.2 TIC chromatogram of the standard solutions of 18 kinds of organophosphorus pesticides by GC-MS/MS

表2 18種有機磷農藥質譜信息Table 2 Mass spectrometry information of 18 kinds of organophosphorus pesticides

2.4 基質效應的評價

通過與純溶劑標準品比較，發現相同濃度的基質液的農藥出峰面積大于在溶劑中的出峰面積， |ME|值介于5.23～228.49%，主要表現為基質增強效應。為保證定量結果準確，本研究采用基質匹配標準曲線來準確定量。

2.5 方法的回歸方程、相關系數和定量限

經考察其線性相關系數(r2)均大于 0.99，表明在其質量濃度范圍內7種農藥的線性關系均良好，能較好地克服樣品提取、凈化及上機測定過程造成的誤差。以辣椒為代表基質，使用辣椒空白樣品作為基質添加濃度為100 μg·L-1的農藥標準品后按“1.3.1”方法進行試驗操作，以信噪比≥10計算LOQ，經過計算該法的LOQ介于0.004～0.009 mg·kg-1，低于國家標準GB 23200.113-2018《植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜 質譜聯用法》[13]LOQ的限值，能滿足日常檢測的需求。

2.6 方法的回收率和重復性

由表3可知，在添加水平為0.05 mg·kg-1時，各供試樣品對不同農藥項目的回收率介于60%～120%，在添加水平為0.10、0.50 mg·kg-1時，各供試樣品對不同農藥的回收率介于80%～110%，檢測結果相對標準偏差RSD(%)均小于5，表明本研究建立方法得到的數據穩定可靠。

表3 18種農藥在7種辛辣蔬菜中的回收率(n=6)Table 3 Recoveries of 18 kinds of pesticide residues at 7 kinds of pungent vegetables (n=6)

續表3

2.7 實際樣品檢測

對抽檢的21批次樣品進行檢測，在1份生姜檢出毒死蜱，濃度為0.018 mg·kg-1，其檢出值皆在其線性濃度范圍之內，根據GB 2763-2021《食品中農藥最大殘留限量》國家標準，含量低于MRL。

3 討論和結論

乙酸乙酯、甲醇、丙酮和乙腈均為農殘分析常用的提取溶劑，乙酸乙酯易于提取蠟質、脂肪等非極性提取物，但其不溶于水，對水中溶解度稍大的目標物回收率較低；甲醇的極性最強，但對部分農藥的提取率卻不如乙腈；丙酮易于提取樣品中的色素，但因其與水互溶較難分離[14]，乙腈作為主流提取溶劑具有最佳的提取效果。凈化劑中的PSA 用于吸附極性有機酸、脂類和糖類，GCB用于吸附甾醇和色素類雜質，但過量的GCB會吸附平面結構的農藥，造成部分農藥回收率降低[15]。本研究確定PSA的最佳用量為100 mg，GCB的最佳用量為10 mg，回收率最高達到93.42%，表現出較好的回收效果。18種有機磷農藥在0.05～2.00 mg·L-1范圍內線性良好(r2>0.99)；在0.05、0.10 和 0.50 mg· kg-1水平的平均回收率介于61.25%～119.68%，相對標準偏差RSD(n=6)均小于5.0%，說明本方法具有較好的準確度和穩定性。

本研究建立了運用GC-MS/MS 前處理技術，結合GC-MS/MS對常見18種有機磷農藥進行分析檢測，通過改善提取溶劑、質譜參數、不同分散劑比例，取得較好的檢測效果。該方法具有簡便高效、經濟節約、結果準確等特點，適合有機磷農藥在香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒等樣品中的定量檢測與分析。